产品详情
免RNA提取RT-PCR试剂盒
产品及特点本产品是一种免 RNA 提取的 RT-PCR 试剂盒,它使用精心优化的细胞裂解液直接裂解培养细胞,然后直接在细胞裂解液中进行 RT,再用 cDNA 进行 PCR或荧光定量 PCR。本产品特点如下:
1. 免 RNA 提取,从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步骤,省略了整个 RNA 提取过程。
2. 灵敏度不低于常规方法(先提总 RNA 再进行 RT-PCR),不但可以检测到低拷贝的 RNA,还可用于检测 miRNA。
3. 整合了去除基因组 DNA 的步骤,只检测 RNA,无需担心基因组 DNA 的污染。
4. 每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织(如 LCM样品),验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等,但不能用于U937 细胞系。
5. 两步法 RT-PCR,后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR,也可用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR,也可用于其他定量 PCR(如 TaqMan),非常灵活。
6. 即适用于少量样品,也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。
7. 本产品足够用于 50 次 20μL 体系的 RT 和 600 次 30μL 体系(或约 200 次100μL 体系)的 PCR。
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
溶液 A 130957a 25 mL
溶液 B 130957b 0.5 mL
MMLV 逆转录酶 (含 RI) 60906a 100 μL
RT Buffer(含 dNTP) 60906b 300 μL
PCR MagicMix 3.0(含染料) 90805 9 mL
RNase-free 水 80403 10 mL
使用手册 130957sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期两年。
自备试剂 RT 引物、PCR 引物对
使用方法注意:无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。 强烈建议使用的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase,用气相 RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷,最好用空 枪头盒盛乙醇。
一、细胞培养、裂解
1. 按常规方法培养细胞、胰酶消化并计数。
2. 转移 1×10E5 个细胞到离心管中,400×g 离心 4 分钟。
3. 吸弃上清(即培养基),保留细胞沉淀。
4. 用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞,并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。
5. 转移 10 μL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中,并加入 10 μL 的溶液 B,此 时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。
6. 迅速将离心管插入浮子中,放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 μL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。
7. 在室温的水浴锅中快速解冻细胞,涡旋 10 秒后短暂离心数秒,将管中液体 (细胞裂解液)转移到新的离心管中,放冰上待用。
二、RT(逆转录)反应合成 cDNA
8. 按下表设置 RT 反应体系(以 20 μL 体系为例):
成分 样品管 阴性对照管 细胞裂解液(含 RNA) 2.5 μL 2.5 μL RT Buffer(含 dNTP) 6 μL 6 μL MMLV 逆转录酶(含 RI) 2 μL 无 RT 引物(100ng/μL) 1 μL 1 μL RNase-free 水 补水到 20 μL 补水到 20 μL
9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
10. 70℃保温 10 分钟以终止反应,然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 为 PCR 模板使用,不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存。 三、PCR 方案一(RT 产物全部用于 PCR)
11.在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分(以 100 μL 体系为例): 成分 每管加入量 PCR MagicMix 3.0(已加染料) 50 μL 自备正向 PCR 引物 (100 ng/μL) 2 μL RNase-free 水 补水到 100 μL
12.直接进入第 14 步。
四、PCR 方案二(部分 RT 产物用于 PCR)
13.按下表设置 PCR 反应体系(以 30 μL 体系为例):
成分 每管加入量
PCR MagicMix 3.0(已加染料) 15 μL
cDNA 样品(RT 反应产物) 1-5 μL
自备正向 PCR 引物 (100 ng/μL) 1 μL
自备反向 PCR 引物 (100 ng/μL) 1 μL
RNase-free 水 补水到 30 μL
注意:RT 引物可以用做反向 PCR 引物。
14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定,下面的参数只做参考):
过程 温度 时间
预变性 94℃ 5 min
PCR 反应
(35 个循环)
94℃ 1 min
55℃ 1 min
72℃ 2 min
后延伸 72℃ 10 min
四、电泳检测
15.取 5-10 μL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要额外再加电泳上样液。