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酿酒酵母EGY48化学感受态细胞
EGY48 菌株是 LexA 系统酵母双杂实验用菌株,MATa 型,可直接转化质粒进行蛋白 互作验证或筛库试验;Transformation marker 为: his3, trp1, ura3,报告基因为: LEU2;报告基因 UAS(上游激活序列)来源于 LexA op(x6),只有当 Bait 和 Prey 互作 时才能启动 LEU2 表达。EGY48-LexA 酵母双杂系统需要三种质粒配套使用:pLexA、 pB42AD、p8op-LacZ。质粒 pLexA 的筛选标志为 HIS3,用于表达 DNA-BD(来自原核 的 202 个氨基酸残基组成的 LexA 蛋白)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒 pB42AD 的筛 选标志为 TRP1,用于表达 AD(来自疱疹病毒的 88 个氨基酸残基组成的 B42AD 蛋白)与目 标蛋白(Prey)的融合蛋白;报告质粒 p8op-LacZ 的筛选标志为 URA3,报告基因为 LacZ, 报告基因 UAS 来源于 LexA op(x8),只有当 Bait 和 Prey 互作时才能启动 LacZ 表达。 EGY48感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株,
本产品经特殊工艺制作而成,经 PGBKT7质粒检测转化效率为104 cfu/μg DNA。
菌株基因型如下: MATα,ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-LEU2
规格及成分 成分 编号 包装
EGY48 感受态细胞 140387A 0.1 mL×10
Carrier DNA,5 μg/μL 140387B 100 μL
PEG/liAC 140387C 5 mL
使用手册 1 份
运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存,Carrier DNA -20℃保存;PEG/liAC 4℃保存;有效 期半年。
自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等
使用方法
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μL,可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后,向感受态细胞悬液中依次加入预冷的目的质粒 2-5μg,Carrier DNA(95-100℃ 5 分钟,快速冰浴,重复一次)10μL,PEG/LiAc 500μL,吹 打混匀,30℃水浴 30 分钟(15 分钟时翻转 6-8 次混匀)。
3. 42℃水浴 15 分钟(7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀)。
4. 5000 rpm 离心 40 秒, 弃上清。取 400μL ddH2O 重悬沉淀,5000rpm 离心 30 秒,弃上清。
5. 取 50μL ddH2O 重悬沉淀,涂板,29℃培养 48-96 小时。
注意:
1. EGY48 酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为 27-30℃;高于 31℃,生长速度和转 化效率呈指数下降。
2. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢, 以转化涂板为例:涂 YPDA 平板 29℃,48h 培养可见直径 1mm 克隆;涂 SD 单缺平 板 29℃,48-60h 培养可见直径 1mm 克隆,涂 SD 双缺平板 29℃,60-80h 培养可 见直径 1mm 克隆,涂 SD 三缺或四缺平板 29℃,80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。