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金黄色葡萄球菌的检测方法与注意事项!
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)也称“金葡菌”,隶属于葡萄球菌属,是革兰氏阳性菌代表,为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃,pH为7.4,耐高盐,可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中,空气、污水等环境中也无处不在。
一、菌种简介
平台编号:bio-59957
提供形式:冻干物
拉丁属名:Staphylococcus aureus
中文名称:金黄色葡萄球菌
属名:Staphylococcus
种名加词:aureus
其它中心编号:=ATCC 27217
来源历史:←中国检验检疫科学研究院(22003) ←军事医学科学院
收藏时间:2008.1.5
资源归类编码:15131315101
模式菌株:非模式菌株
用途:研究、质量控制,《GB 4789.10-2010金黄色葡萄球菌检验》阳性对照菌株。
主要用途:研究;分析检测
具体用途:研究、质量控制
特征特性:G+球菌,鸟氨酸脱羧酶阴性,发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖产酸不产气。发酵甘露醇。甲基红反应阳性,伏-普实验弱阳性。产金黄色色素。低毒性。兼性厌氧,最适pH7.0-7.5。
生物危害程度:三类
致病对象:人畜共患
致病名称:溃疡、脓肿等
传播途径:经口、呼吸道、接触
培养基:蛋白胨 5.0g,牛肉浸取物 3.0g,NaCl 5.0g,琼脂 15.0g,蒸馏水 1.0L,pH7.0。[注] 培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO4·H2O,则有利于产生芽孢。
培养温度:37℃
资源保藏类型:培养物
保存方法:真空冷冻干燥法
实物状态:有实物
共享方式:公益性共享;资源纯交易性共享;合作研究共享;资源交换性共享
二、储存条件
冻干菌种和试管斜面请置于 2-8℃冷藏。西林瓶菌种请置于-20℃冷冻。
三、培养条件
1、培养基编号:CM0002
2、培养基成分:蛋白胨 5.0g,牛肉浸取物 3.0g,NaCl 5.0g,琼脂 15.0g,蒸馏水 1.0L,pH7.0。[注] 培养芽孢杆菌时加入 5mg MnSO4·H2O,则有利于产生芽孢。
3、需氧类型:好氧
4、培养温度:37℃
四、检测方法
1、传统分离鉴定方法
世界上对食品中金黄色葡萄球菌的检测通常采用生化鉴定的手段,并在初期采用平板划线分离。当前我国检测食品中金黄色葡萄球菌依据国家标准《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》(GB4789.10-2016)中的方法进行。国家标准执行内容包括定性检测和定量检测两部分。在无菌条件下接种到肉汤中进行前增菌,最后将培养物接种划线,根据生化鉴定方法进行血清学鉴定。传统生化鉴定方法操作简单,稳定性强,成本低,是目前最常用的鉴定方法。
2、免疫学检测方法
免疫学检测方法主要是基于免疫学理论研究,其是通过设计的抗原、抗体和免疫细胞,检测抗原和抗体的结合以及免疫细胞分泌的细胞因子的,从而达到检测目的一种实验方法。该技术方法主要包括酶联免疫法、免疫荧光法、免疫胶体金法等。
①酶联免疫法:其原理是利用抗体与抗原在载体表面的特异性结合,加入某种酶,酶与抗体或抗原结合在一起,从而形成可以跟踪抗体或抗原的标记物,由于抗原或抗体与受检样品的反应产生抗原或抗体的复合物,此时加入酶反应显色底物,产物的量的大小与检测物质的量的大小呈正相关,分析显色情况从而确定样品中待检测物的含量。目前已经开发了几种根据 ELISA 技术用于检测培养上清液和食物样品 (例如干酪,土豆沙拉,火腿和牛奶)中的金黄色葡萄球菌。
②免疫荧光法:免疫荧光技术利用荧光色素对抗体或抗原进行标记,然后检测目标抗原或抗体。抗原和抗体特异结合后,通过考察荧光信号的强弱进行定性定量检测。与酶介导的免疫测定相比,基于荧光的免疫测定具有提供高通量分析和灵敏度的更大潜力。
③免疫胶体金法:该方法借助硝酸纤维膜为固定相载体,样品溶液通过毛细作用在试纸条中移动,在试纸条中同时加入了针对待检测物质特异性的抗原或抗体。与 ELISA 技术相比,免疫胶体金技术操作更为简单,对实验人员没有特别的技术要求,适合基层单位和现场诊断。但是免疫胶体金相比较 ELISA 法而言,灵敏度更低,且使用范围不广,需要进一步的研究。总体而言,免疫胶体金有着强大的发展潜力和广阔的应用前景。
3、分子生物学检测方法
该技术主要包括聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,核酸探针技术,环介导等温扩增技术等技术。
①聚合酶链反应技术:该方法的原理是在 DNA聚合酶的作用下,游离的脱氧核糖核酸参照碱基互补配对的原则,以模板 DNA为主链,通过提供一段引物,迅速的扩增 DNA 的双螺旋结构。PCR 技术特异性强、敏感度高,已广泛应用于医学、生物学等领域中。PCR 作为致病微生物的检测方法,稳定性强,是目前主流的检测方法。在微生物检测应用中,引物的设计以及靶序列的选择是 PCR 方法的核心。PCR 法同时也有一定的局限性,由于该方法需要对样品进行增菌,食品成分复杂,会对实验造成干扰。与其他方法相比,PCR 技术仪器设备价格高,需要花费的成本较高,推广普及需要一定的时间和资金支持。
②核酸探针技术:通过使用基因特异性核苷酸序列作为探针与目的 DNA 杂交的一种核酸杂交技术,通过检测该段特异性的标记物,从而判断是否含有目标微生物。核酸探针具有分子生物学检测技术的灵敏度高、特异性强的优点,但是实验周期长,操作繁琐,如果样品中目标微生物含量过低,极易造成样品目标微生物未检出,出现假阴性的实验结果。
③环介导等温扩增技术:该技术基于 DNA扩增技术,能够在恒温条件下,根据设计的多对引物,利用链置换型 DNA 聚合酶快速的进行核酸的扩增。与 PCR 方法比较,环介导等温扩增法操作更加快捷简单,花费成本较低,且对仪器要求低,能够广泛利用在食源性致病微生物的检测中。
4、其他方法
试剂盒法:试剂盒法通常将十多种,甚至几十种培养基或成分集中在特定微型装置内,通过观察微生物的生长和代谢过程的某些产物或现象,对试验现象进行分析,将传统试验中多次试验通过一次完成,缩短了检测时间。此法可大大缩短测试时间,在24 h内得出结果,甚至某些可缩短至4 h内。目前,用于检测金黄色葡萄球菌的成品试剂盒有API、MIS等。
测试片法:其将纸膜、纸片或胶片附着相关培养基和特定显色液作为金葡菌的培养载体,依据金葡菌在载体上的生长以及显色情况,来衡量食品中金黄色葡萄球菌的存在数量,该方法简便易行,但结果精度不高。
四、注意事项
1、菌种常规培养时间:细菌 1-2 天,酵母 3 天,霉菌 5-7 天,大型真菌 7-10 天。
2、试管斜面菌种请尽快转接,不建议长期存放。
3、初次使用时请按照本说明书推荐条件进行复活培养,如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失,我单位不负责任。
4、使用者应保证菌种的安全存储和操作,带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃
5、与菌种相关的其它信息请参阅中国微生物菌种查询网网站(www.biobw.org)。