pACYC184大肠克隆质粒

基本信息

复制子: p15A ori

质粒分类: 大肠系列质粒；大肠克隆质粒；基因克隆质粒

质粒大小: 4245bp

原核抗性: 氯霉素Chl（25μg/ml）,四环素Tet（10μg/ml）

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

5'测序引物: Tcr-F（GAAGTCATGCGCCGGTTAAG）

3'测序引物: pBRrevBam-R (GGTGATGTCGGCGATATAGG)

备注: 丰富的酶切位点

质粒简介

        pACYC184质粒是一种原核表达载体，含有p15A复制起点的大肠杆菌质粒克隆载体。这允许pACYC184在与ColE1相容性组的质粒（例如pBR322，pUC19）的细胞中共存。它是一个低拷贝数载体，每个细胞约15个拷贝，但可以用壮观霉素放大。由于cat基因的存在，氯霉素不能用于提高质粒产量（阻碍菌体复制，不阻碍质粒扩增）。

        pACYC184 is an E. coli plasmid cloning vector containing the p15A origin of replication (1-4). This allows pACYC184 to coexist in cells with plasmids of the ColE1 compatibility group (e.g., pBR322, pUC19). It is a low copy number vector, at about 15 copies per cell (5), but can be amplifed with spectinomycin. Chloramphenicol cannot be used for amplifcation due to the presence of the cat gene.

质粒图谱
 

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。