产品详情
pCANTAB-5E噬菌体展示质粒(非空载)
基本信息
质粒大小: 5216bp
质粒标签: N-g3 signal,C-E tag
原核抗性: 氨苄青霉素Amp
克隆菌株: 大肠杆菌TG1
培养条件: 37℃,有氧,LB
质粒简介
本系统是用于抗体基因表达,制备重组抗体。宿主菌 TG1 为质粒载体pCANTAB5e 复制和表达的宿主菌,无抗性,用 2×YT 培养基,37℃进行培养。载体 pCANTAB5e 为用于构建重组单链抗体 scFv 的载体,具有氨苄抗性,大小为4522bp,具体图谱及酶切位点如下示。辅助噬菌体 M13K07 用于拯救噬菌粒,具有卡那抗性,在其辅助下噬菌粒得以复制,并以融合的形式表达在噬菌体表面。在 scFv 基因后面含有一段编码 Tag 尾肽(E-Tag)的序列,在尾肽后面有一琥珀(Amber)终止密码子,位于 scFv 基因与 cpIII 基因之间,在抑制型细菌 TG1 中,这种琥珀密码子只有 20%有效,故在蛋白翻译过程中可以通读而形成 scFv-cpIII融合蛋白;但在非抑制型菌株中,如 HB2151,此终止子被识别,同时 scFv 基因在翻译过程中在 cpIII 基因前终止,形成独立的抗体蛋白,滞留于细胞膜间隙,并在长时间培养后泄漏在培养液中,形成可溶性表达。
【操作方法】本方法来源于网络,本平台未做实验证实,仅供参考。
1. 辅助噬菌体毒种制备
1) 将辅助噬菌体 M13K07 划线于 2×YT 琼脂平板上;
2) 制备 2×YT 半固体琼脂(0.7%琼脂)为上层琼脂(Top Agar),冷却至 50 ℃时,取 4 mL Top Agar 并加入 0.5 mL 过夜培养的新鲜 TG1 菌(OD660 达 0.8),充分混匀,沿着划线浓度从低至高的方向,倾注 Top Agar;
3) 37℃培养 6-12 小时,用接种针挑取单个噬菌斑,接种于 30-200 mL 2×YT-K(kanamycin 70 μg/mL),37℃充分振荡培养 10-14 小时;
4) 8000 rpm 离心 15 min,4 ℃;
5) 小心取上清,建议用 0.45μm 滤膜过滤后,分装无菌小管,存放 4℃至少可用半年。
2.噬菌体毒种的滴定
1) 准备不含任何抗生素的 2×YT 培养平板 5-6 个;
2) 用 2×YT 培养基配制 0.7%琼脂平板,即为表层琼脂(Top Agar),冷却至 42℃并在 42℃恒温保存;
3) 将上述噬菌体溶液用培养基做 10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 稀释;
4) 取过夜培养的 TG1 菌液(OD660=1 左右),分装小试管,500μL /小试管,标明10-6 至 10-10 稀释度;
备注:宿主菌的制备请参照 TG1 菌株说明书进行。
5) 加入以上步骤 3 中依次稀释的噬菌体 100μL 到每个相应的标准稀释度的试管中,充分混匀,37℃轻柔振荡反应 30 min;
6) 加入 Top Agar 3 mL 至每个试管中,立即浇注事先准备好的平皿,37℃培养过夜;
7) 计算平皿上的空斑数,乘于相应稀释倍数,一般浓度可达 1012pfu/mL。
【注意事项】
1.噬菌体毒种,在使用前应按以上推荐的方法进行浓度滴定;
2.噬菌体毒种存放在 4℃下即可,不可-20℃或更低温度冻存;
质粒图谱
扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(请务必转化挑单克隆重提后使用)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl 无菌水溶解质粒;
②取2μl质粒加至100μl 感受态中,冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;
(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入500μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
④取10μl、100μl复苏液,并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h;
(如果菌落过多,请将质粒稀释后再转化。如果无菌落,请加入10μl质粒离心全涂转化)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌:四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌:穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、平板:直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒:单独提取的液体质粒收到后可直接使用。