产品详情
pBeloBAC11细菌人工染色体质粒(单拷贝)
基本信息
复制子: OriS
质粒大小: 7507bp
原核抗性: 氯霉素Chl
克隆菌株: 大肠杆菌DH5α
培养条件: 37℃,有氧,LB
备注: 细菌人工染色体BAC质粒
质粒简介
随着基因组学时代的到来,克隆并利用生物的重要基因,研究这些基因的结构、功能和进化已成为遗传学领域的热点之一。生物体的许多重要性状都涉及到复杂的生理生化反应,受多基因或基因簇的控制,与成百上万碱基的DNA片段相关,此外,复杂基因组的物理作图和基因的图位克隆也涉及到大片段的研究,因此提高载体的容纳量一直是克隆载体的重要发展方向之一。
目前比较理想的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)是指一种以F质粒(F-plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体,命名为pBACs,其容量在50 - 300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌都呈单拷贝。
BAC是以大肠杆菌致育因子(F因子)为基础的合成载体。F因子也称为F质粒,是一种“性质粒”,它可将宿主当然体基因转移到另一宿主细胞。F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝,一般为每个细胞1-2个拷贝,其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒,限制了细胞内质粒分子间的重排,降低了重组BAC中外源DNA的重排水平和嵌合度。此外,F因子具有携带1M bp插入片段的潜能,这就使构具有大容量克隆能力的BAC载体成为可能。
BAC载体主要包括oriS,repE(控制F质粒复制)和parA、parB(控制拷贝数)等元件。以BAC为基础克隆的载体成嵌合体的频率较低,转化效率高,而且以环状结构存在于细菌体内,易于分离纯化,已被科学界广泛接受。目前主要用于大片段基因组文库的构建和大的基因簇(gene cluster)的相关研究,在各类生物基因组计划中发挥重要作用。
质粒图谱
扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(请务必转化挑单克隆重提后使用)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl 无菌水溶解质粒;
②取2μl质粒加至100μl 感受态中,冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;
(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入500μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
④取10μl、100μl复苏液,并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h;
(如果菌落过多,请将质粒稀释后再转化。如果无菌落,请加入10μl质粒离心全涂转化)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌:四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌:穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、平板:直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒:单独提取的液体质粒收到后可直接使用。