pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒

基本信息

复制子: pUC ori,f1 ori

终止子: SV40 poly(A) signal

质粒分类: 哺乳系列质粒；哺乳荧光质粒；哺乳绿色质粒

质粒大小: 4150bp

质粒标签: C-AcGFP1

原核抗性: 卡那霉素Kan（50μg/ml）

筛选标记: 新霉素Neo/G418

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 293T等哺乳细胞

诱导方式: 无须诱导，瞬时表达

5'测序引物: AcGFP-1-F (GCGTCGATTTTTGTGATGCTC)

3'测序引物: Sv40-polyA-R（GAAATTTGTGATGCTATTGC）

备注: 哺乳细胞启动子检测载体

质粒简介

        pAcGFP1-1质粒是 AcGFP的衍生物，来自Aequorea coerulescens。 AcGFP1已经优化了更亮的荧光。（激发最大值= 475nm;发射最大值= 505nm）AcGFP1基因的编码序列含有沉默碱基变化，其对应于人类密码子使用偏好。

        pAcGFP1-1是一种无启动子载体，可用于监测插入到多克隆位点（MCS）中的不同启动子和启动子/增强子组合的转录。AcGFP1上游的序列已经转化为Kozak共有翻译起始位点（2），以增强真核细胞中的翻译效率。AcGFP1基因下游的SV40多聚腺苷酸信号直接适当处理AcGFP1 mRNA的3'末端。载体主链含有用于在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中复制的SV40来源，用于在大肠杆菌中繁殖的pUC起始点和用于单链DNA生产的f1起点。新霉素抗性盒（Neor）允许使用G418选择稳定转染的真核细胞。该盒由SV40早期启动子,Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和来自单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV TK）基因的多聚腺苷酸化信号组成。盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性。

       pAcGFP1-1 encodes the green fuorescent protein AcGFP1, a derivative of AcGFP from Aequorea coerulescens. AcGFP1 has been optimized for brighter fuorescence. (Excitation maximum = 475 nm; emission maximum = 505 nm.) The coding sequence of the AcGFP1 gene contains silent base changes, which correspond to human codon-usage preferences .

       pAcGFP1-1 is a promoterless vector that can be used to monitor transcription from different promoters and promoter/enhancer combinations inserted into the multiple cloning site (MCS). Sequences upstream of AcGFP1 have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (2) to enhance translation effciency in eukaryotic cells. SV40 polyadenylation signals downstream of the AcGFP1 gene direct proper processing of the 3' end of the AcGFP1 mRNA. The vector backbone contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T antigen, a pUC origin of replication for propagation in E. coli, and an f1 origin for single-stranded DNA production. A neomycin-resistance cassette (Neor) allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. This cassette consists of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene. A bacterial promoter upstream of the cassette expresses kanamycin resistance in E. coli.

质粒图谱

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。