pPICZαB毕赤酵母质粒

基本信息

启动子: TEF1，AOX1，EM7

复制子: pUC ori

终止子: AOX1 TT

质粒分类: 酵母系列，毕赤酵母表达载体

质粒标签: C-Myc, C-His

原核抗性: Zeo

筛选标记: Zeo

克隆菌株: DH5α

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 酵母细胞

诱导方式: 甲醇诱导

5'测序引物: AOX5:GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3'测序引物: AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT

质粒简介

   pPICZαA，B和C是3.6 kb的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个N-端多肽，编码酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α-因子分泌信号。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水 平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。pPICZα  A，B和C系列载体包含以下内容：①5'端含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz等人，1989;tschopp等人，1987A）。②α-因子分泌信号能够分泌性表达目的蛋白。③Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; Drocourt等人，1990）。④C-端含Myc和His标签，可以用于检测和纯化重组蛋白。⑤pPICZ A, B, C三种读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。

质粒图谱

扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
        1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）
        ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；
        ②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

        ③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

        ④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）

        ⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

        ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

        2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

        3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

        4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。