产品详情
cDNA第一链合成试剂盒(逆转录试剂盒、RT试剂盒)
1st-Strand cDNA Synthesis Kit
本试剂盒提供合成cDNA第一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MuLV RT)高效合成mRNA的全长cDNA拷贝。
产品特点:
1. 使用突变的反转录酶,内源RNase H活性低。
2. 最长可合成13Kb的cDNA。
3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA 专一性引物三种引物(前两种本试剂盒提供)。
4. 总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA 均可作为模板。
5.可用于cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
一:合成PCR用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT反应体系:
引物
2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。
3. 再加入5μl RT Buffer(含dNTP)。
4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板,可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物,则改成25℃ 5分钟。
5. 加入2μL MMLV逆转录酶(含RI),反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT反应。
7. 70℃保温10分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR 模板使用,不需要纯化。
二:合成建文库用的1st-strand cDNA
1. 按下表配制RT反应体系:
2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。
3. 再加入5μl RT Buffer(含dNTP)。
4. 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板,可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物,则改成25℃ 5分钟)。
5. 加入2μl MMLV逆转录酶(含RI),反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。此步为RT反应。
7. 70℃保温10分钟以终止反应,放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。
三:用对照模板合成cDNA(需要用同位素,需要对照的客户需要单独跟我司联系)
1. 按下表配制RT反应体系:
2. 70℃保温5分钟后立即冰浴。
3. 再加入5μL RT Buffer(含标记dNTP,本试剂不提供)。
4. 37℃保温5分钟。如果使用随机引物,则保温温度只能是25℃。
5. 加入2μL MMLV 逆转录酶(含RI),反应终体积为20μL。
6. 42℃保温60分钟(但如果使用随机引物,需要先25℃保温10分钟,然后再转移到42℃保温60分钟)。
7. 加1μL 0.5M EDTA,放置在冰上待用。
8.电泳检测。合成的cDNA的量一般有加入RNA总量的50%以上,电泳一般能出现1.1Kb的片段(如果使用随机引物,将出现多个小片段)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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