产品详情
DNA快速连接试剂盒
Rapid DNA Ligation Kit
DNA连接反应通过T4连接酶催化双链DNA的3′-OH和5′-P形成磷酸二脂键而将DNA共价连接在一起。被连接的DNA末端可以是粘末端(例如限制性切割EcoR I产生的末端),也可以是平末端(限制性切割Sma I产生的末端)。Pheiffer等人发现PEG可以促进T4 DNA连接酶催化的连接反应[NAR,11,7853-7871,1983],连接反应只需十分钟即可完成。
产品特点:
1.超快,整个连接反应只需要室温5分钟左右,反应液可以直接用于转化实验。
2.高效,溶液配方经过优化,每ug 插入DNA连接转化得到的重组子可达107左右。
3. 既可用于平末端连接,也可用于粘末端连接,包括PCR产物与T载体的连接。
4. 简单,客户只需要提供载体和插入片段即可。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
一:连接反应
1.在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分(以10μl 体系为例):
?注:插入DNA片段的摩尔数最好是载体的3-10倍,如果载体长度为3000bp,则所需插入DNA片段折合成重量(ng)=(插入DNA片段bp 数×50 ng×N)÷3000bp。N就是自己选定的插入DNA片段与载体的摩尔比。
2. 最后在每管中加入1μl溶液B,轻柔吹打混合均匀后用微量离心机将液体全部甩到管底。
3.室温放置至少5分钟,最长可以放置过夜。
4. 70℃保温10分钟。此步可以灭活有关的酶,否则转化效率有所降低。
5. 根据使用的转化方法,每管各取适量用于转化实验,余下的放置在-20℃保存。
二:细菌转化及筛选(仅供参考,本产品不提供相关试剂)
6. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
7. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀。
8.在冰上放置30分钟。
9. 将离心管放42℃热休克90秒,然后快速将其转移到冰浴中放置1~2分钟。
10. 每管中加900μl LB培养基,37℃振荡培养1小时复苏细胞。
11. 将100μl 复苏涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(根据载体情况也可能需要加上X-gal和IPTG)。
12.室温4,000rpm离心剩余的900μl 复苏细胞5分钟,弃去800μL上清,用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要,否则培养板将在37℃排除水分,细菌将随水在培养基上到处游动,不能形成单个菌落。
14. 倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10),自联对照只有少数几个菌落,样品组的菌落数取决于PCR 回收片段的质量。
15. 按常规方法筛选重组子。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!