产品详情
可保种型蓝白T载体
Blue-White Vector T
本产品是环状的可以制备Clion蓝白T载体的质粒DNA。T载体是克隆PCR扩增产物的必不可少的工具,但是由于市场上的各种T载体质量参差不齐,用户很难购买到满意的产品;同时购买的T载体为线性DNA,不能保种,必须反复购买,累计成本很高。为解决这一问题,我司特推出可保种型T载体,用户只需要购买Xcm I内切酶就可以自己制备高质量的T载体,随用随配,十分方便。
产品特点:
1.一次购买,终身拥有。本产品提供制备T载体用的环形质粒DNA,可以象其他质粒一样保种并长期保存。
2. 随用随配,十分方便。用户只需要提供Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件,就可以自己制备T载体。整个过程只需要两天。
3. T载体含T 率为100%。本方法不是使用传统的加尾法,而是使用Xcm I酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为1.3 Kb的Xcm I DNA片段,经Xcm I酶切后回收得到的质粒DNA(T载体)两端自然全部带有T 突出,比例远远高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T载体。
4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白T载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点,便于后续克隆; Xcm I 位点在Alpha 互补区,可以使用蓝白斑筛选重组子;两边还有T7和SP6 RNA聚合酶启动子,便于制备RNA探针。
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期两年。
使用方法:
一.细菌的转化
1. 将100μl感受态细胞于冰上解冻。注意:最好使用end A1菌种(如DH1、DH5、DH5α、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考《分子克隆手册》等参考书)。因为这类细菌所含DNase少,制备T载体后,残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。
2. 取5-10μl本产品加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中,热休克90秒。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2分钟。
4. 每管中加900μl LB培养基,37℃振荡培养1小时。
5. 取100μl培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落。
二.细菌的鉴定
1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。
2. 按常规的方法进行质粒小量制备。
3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA,如果大规模酶切,需要按比例增加各成分用量:
?37℃保温一小时,65℃保温20分钟使酶失活。
4.电泳,本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。
5. 如果Xcm I酶切图谱正确,则按常规的方法进行细菌的保种。
三. T载体的制备
1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意:一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质(含残留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切质粒。注意:酶切时间最好不要超过一小时,避免残留的DNase对T末端的破坏。
3.电泳后切下含3Kb DNA(既蓝白T载体)的胶段。注意:千万不要用UV照射将要回收的片段,因为UV会使DNA交连,使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大,可以使用绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择,最好在长波(360nm)紫外灯下快速切胶,尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连,可以使用的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)
4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。
5. 测定T载体DNA的浓度后,将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。
四.连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分:
注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3:1-10:1。
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后,16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作说明书进行连接)。
五.细菌转化和鉴定
1. 取5μl连接产物进行转化,具体步骤见本手册一,最好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。
2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定,可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选,可选用的菌落PCR试剂盒(BTN50901)进行快速筛选,需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!