产品详情
植物线粒体总蛋白提取试剂盒
Plants mitochondrial total protein extraction kit
产品及特点 植物线粒体是重要的植物细胞器,负责 ATP 的产生。此外植物很多重要的特性(如
雄性不育)也跟线粒体相关,是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体总蛋白提取的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。
2. 线粒体提取部分提供粗提和精提两种操作方案,粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提,所得线粒体含少量其他细胞器污染,可用于后续的 SDS-PAGE,Western,ELSIA 和蛋白组分析,也可以用于 PCR 级别的线粒体 DNA 和 RNA 提取。
3. 精提利用冷冻超速离心(离心力达 40000g)制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开,得到线粒体精提液,适用于后续的偶联分析、体 外 线 粒 体 蛋 白 合 成 、 线 粒 体 成 份 定 位 等 精 细 实 验 。 也 可 用 于 后 续 的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体 DNA 和 RNA提取。
4. 本产品足够 5 次提取,每次可处理 10g 绿色植物组织(可得 1-2.5 mg 左右线粒体)或 20g 非绿色植物组织(可得 2-5 mg 左右的线粒体)。
5. 采用温和的中性裂解成分,蛋白保持天然活性。
6. 得到的提取物可以直接用于 SDS-PAGE、2D 电泳、免疫印迹分析、蛋白活性测定和 BCA 法及 Lowry 法蛋白定量(不适用于 Bradford 法)。
运输及保存 低温运输, 植物线粒体总蛋白提取溶液 A和B -20℃保存,保存期限一年。
自备试剂 超纯水,可能需要 5 M KOH 调 pH,如果需要去除细胞核 DNA,还需要自备 25mMMgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、DNase 干粉和另购更多植物线粒体提取洗涤液。
使用方法 注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用植
物组织,器皿和溶液均需要在 4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过 4℃。
一:选择组织
1. 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:
植物组织种类 线粒体产率 说明
根和块茎 0.3 mg/10g 如土豆,红薯等
黄化苗(下胚轴、子叶、胚芽鞘) 2-5 mg/10g 多酚含量低于叶片
有光合作用的叶片和子叶 1-2.5 mg/10g 需放置在暗处 3 天
2. 一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片),需将植物提前放在暗
室至少 3 天以降低淀粉含量,否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3. 一次实验需要 40 mL 植物线粒体提取匀浆液、约 90 mL 植物线粒体提取洗涤液
和 35 mL 密度梯度离心介质(配制方式是一次性将 9.8g (8.7mL) Percoll 加入
到 26.3mL 植物线粒体提取离心介质溶液中,充分混匀后得到 35mL 密度梯度
离心介质)。这三种溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其终浓度为 0.1%(100mL
溶液加 0.1g BSA 干粉,轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用)。每次
实验用多少配多少,不要预先将所有 BSA 干粉加入,否则容易长菌。
二:线粒体粗提操作流程
1. 将 10 g 的绿色植物组织(如去叶脉后的嫩叶子,愈伤组织)或 20 g 干净的非绿
色植物组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中 10 分钟,用纸吸干液体
后浸泡在预冷的 40 mL 植物线粒体提取匀浆液(需先加 0.1% BSA)中,在浸
泡状态下剪成 1cm2大小的碎片。注意:如果样品可分成多组平行处理,得到线
粒体粗提物后再汇集,否则线粒体产率将急剧降低。
2. 将植物线粒体提取匀浆液和其中的植物组织碎片转移到 Waring 匀浆器中,中速
匀浆 3 次,每次 15 秒,每次之间间隔 10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也
可使用研磨法。具体操作是将植物线粒体提取匀浆液和其中的植物组织碎片转移
到预冷的研钵中,研磨 3-4 分钟。注意:植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液
酸化,降低 pH,而线粒体对 pH 变化非常敏感,因此建议匀浆后用 pH 试纸检
测匀浆液的 pH,如果低于 7.0,必须用自备的 5 M KOH 将 pH 调到 7.0 以上
才进入下一步。
3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液,穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的 50 mL 的塑
料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4. 在低速固定角度冷冻离心机上 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,沉淀为未破碎的细胞、
破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒,上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷
的 50mL 塑料离心管中。
5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上 4℃ 12,000 g 离心 20 分钟,弃上清液,
所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀,
属于正常现象。
6. 加入 10 mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液(需先加 0.1% BSA,下同)中,用
软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀,需要避免重悬之)。不
能剧烈震荡,否则线粒体容易破裂。
7. 将线粒体重悬液转移到新的 50mL 离心管中,再加入 30mL 预冷的植物线粒体
提取洗涤液(终体积为 40 mL)中,4℃ 1000 g 离心 5 分钟。线粒体将在上清
中。
8. 将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000 g 离心 20 分钟,沉淀为
线粒体。小心弃上清。到此步时,线粒体回收率一般在 15-30%。
9. 在沉淀中加入 2 mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液。用软毛笔轻柔重悬,得到线
粒体粗提液。如果有平行提取,可将最多 4 管线粒体沉淀重悬在 2 mL 植物线粒
体提取洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在 45-75%。
10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体, 乙醛酸循
环体,或细菌)污染,但可直接用于 PCR 级线粒体 DNA 和 RNA 的提取、呼吸链
功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存,则可以在线粒体重
悬液中加入 1/20 体积的自备 DMSO,混匀后分成 0.5 mL/管,然后放-80℃保
存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三:细胞核 DNA 的去除(纯化测序级的线粒体 DNA 才需要进行此操作。本产品不
提供相关试剂,实验步骤仅供参考)
11. 预留 50uL 线粒体粗提液做对照,在约 2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入 40 uL
25mM 的 MgCl2,再加入 200ug DNase 干粉或溶液(总量为 200ug 即可),
混匀后冰上放置 60 分钟降解 DNA。取少量样品(如 50uL)在 PCR 仪器中加
热到 95℃变性
10 分钟灭活 DNase,再取其中的 10uL 和 10uL 预留的样品一
起进行细胞核基因专一性 PCR,如果 DNase 处理的样品没有扩增,而预留样品
有扩增,则表明 DNA 去除比较干净(达到 PCR 检测的极限),则进入下一步。
如果未去除干净,则继续在冰上放置,直到 PCR 检测不到细胞核 DNA。
12. 加入 0.32 mL 预冷的自备 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 预冷的植物线粒体提取
洗涤液。
13. 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000
g 离心 20 分钟,沉淀为去除细胞核 DNA 的线粒体。重悬在 2mL 植物线粒体提
取洗涤液中。
四:线粒体精提操作方案(需要 40000g 的超速冷冻离心机)
14. 在 50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入 35 mL 预冷的密度梯度离心介质(配制
方法见第三步,用前需先加 0.1% BSA)。
15. 将 2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16. 在超速水平离心机上 4℃ 40,000 g 离心 45 分钟,最上层为黄色或橙色的质体
带(如果材料是绿色植物,此带将是绿色),其下的白色不透明的带即为线粒体,
管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下:
17. 用广口吸管(可将 1 mL 蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带,注意避开其上
的质体带过氧化物酶体沉淀,估计所取含线粒体溶液的体积。
18. 在 15-20 分钟的时间内缓慢加入至少 4 倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液。
19. 转入 50 mL 塑料管离心管中,在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟,沉
淀为线粒体。
20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少 4 倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液
中,在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心
20 分钟,弃上清,沉淀即为洗涤后的
线粒体精提物。到此步时,线粒体回收率一般在 5-15%。
21. 将精提的线粒体重悬在 1mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液中。重悬的线粒体可
以立即使用,在冰上最多可放置 5-6 小时。如果需要长期保存,则可以在线粒体
重悬液中加入 1/20 体积的 DMSO,混匀后分成 0.5 mL/管,然后放-80℃保存。
如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五:线粒体总蛋白提取
22. 每 10mg 湿重线粒体沉淀加入 0.5 mL 植物线粒体总蛋白提取溶液 A 和 50μL
植物线粒体总蛋白提取溶液 B,吹打混匀。
23. 冰上放置 30 min 至 1h。
24. 4℃ 12,000 g 离心 1 min。
25. 将上清液转移至一新的 1.5 mL 塑料离心管中即得到蛋白溶液,可置于
-70℃冰箱保存或立即使用。如果要进行 SDS-PAGE 电泳,可取部分样品
到离心管中,加入 5×SDS-PAGE 上样缓冲液(终浓度为 1×),在沸水中
处理 5 min 后立即上样电泳。其他功能检测:请自备方法。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!