产品详情
细菌膜蛋白质微量提取试剂盒
Bacterial Membrane Protein Miniprep Kit
本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细胞后,通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。
产品特点:
1.一步式分离细胞膜和膜蛋白,密度梯度离心法简单快捷。
2. 膜蛋白纯度高,能够去除各种胞浆蛋白的污染,也能去除松散附着在细胞膜上的蛋白,所得膜蛋白主要是整合蛋白。
3. 膜蛋白完整性好,主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。
4. 回收效率高,一般能得到相当于总蛋白量6%的膜蛋白。
5.可用于E.coli,S.typhimurium,K.aerogens,P.aeruginosa,C.crescentus等细菌。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输和保存,DNase I 需要低温保存。有效期一年。
使用方法:
准备:第一次使用本试剂盒时需要将所有DNase I干粉倒入溶液B中,轻柔颠倒使DNase干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存,最好在一个月内完,否则DNase 将逐渐失去活性。此外,最好在实验前1小时将溶液B冰浴预冷。
用法一:小量制备(主要用于上样量比较小的SDS-PAGE电泳等实验)
1.收集20-40mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可),2500g室温离心10分钟后弃上清。
2.加入2mL溶液A,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液A中。
3.2500 g室温离心10分钟后弃上清。
4.加入0.5mL溶液B(必须已经提前加入了DNase I干粉),轻柔吹打使细菌重悬。注:如果细菌起始量没有20-40mL,溶液A的用量可以等比例降低。重悬在溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
5.用超声或French Press方法裂解细胞。如果用French Press方法,则需要处理至少两次,每次的压力为9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不论用哪种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌裂解过程,直到80%以上的细菌都裂解为止。
6.2500g室温离心8分钟后小心转移上清到新的10mL-15mL塑料离心管中(如Beckman Optima 台式超速离心机离心管),弃沉淀(未破裂细胞)。
7.在上清(细菌裂解液)中加入5mL预冷的溶液C,轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60分钟。其间可以轻柔颠倒混匀3-5次。
8.用 Bechman Optima 台式超速离心机115000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
9.小心移弃上清,在沉淀中加入0.2mL溶液A,充分吹打混匀。
10.用Beckman Optima 台式超速离心机 115000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
11.小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存,也可以直接加入0.1mL自备的,跟后续实验兼容的缓冲液(如1×SDS-PAGE上样液中,可从本公司购买),所得膜蛋白的浓度将在1mg/mL左右。
用法二:大量制备(主要用于上样量比较大的2D电泳等实验)
1.收集200-400mL 过夜培养的细菌饱和培养液(OD420在1.5左右即可),2500 g室温离心10分钟后弃上清。
2.加入20mL溶液A,轻柔吹打,将细菌重悬于溶液A中。
3.2500 g室温离心10分钟后弃上清。
4.加入5mL溶液B(必须已经提前加入了DNase I干粉),轻柔吹打使细菌重悬。注:如果细菌起始量没有200-400mL,溶液A的用量可以等比例降低。重悬在溶液A中的细菌可以放-80℃长期保存。
5.用超声或French Press方法裂解细胞。如果用French Press方法,则需要处理至少两次,每次的压力为9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不论用哪种裂解方法,都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解,否则还需要重复细菌裂解过程,直到80%以上的细菌都裂解为止。
6.2500g室温离心8分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中,弃沉淀(未破裂细胞)。
7.在上清(细菌裂解液)中加入50mL预冷的溶液C,轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60分钟。注:可以在大烧杯中装冰,然后将装有样品的小烧杯放入,在放入干净的搅拌子,以最低速度搅拌。
8.用 Beckman Type 55.2 Ti转头 115000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。
9.小心移弃上清,在沉淀中加入2mL溶液A,充分吹打混匀。
10.用Beckman Type 55.2 Ti转头 115000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致。
11.小心移弃上清,所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在1mL自备的,跟后续实验兼容的缓冲液(如1×等电点电泳上样液,可从本公司购买),所得膜蛋白的浓度在1mg/mL左右。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!