产品详情
一站式GST标记蛋白质微量纯化套装
One-Stop GST-Tagged Protein Miniprep Pack(A)
重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶能提高重组蛋白的水溶性,所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合,并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立,是目前分离纯化GST 标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的,其原理如下:
产品特点:
1.一站式套装,含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱,用户只需要提供表达GST 标记蛋白的细菌(酵母、杆状病毒、培养细胞)即可,非常方便。
2.专一性强,一次过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。
3.只能在非变性条件下使用,只可用于纯化没形成包涵体的GST 标记蛋白。
4.每次可以处理20mL的表达菌液,适合初步筛选和鉴定。
5.提供4mL浓度为50%的谷胱甘肽-Agarose 介质,可吸附5-10mg GST 标记蛋白质。
6.本介质可以反复使用多次。
试剂盒组成:
储存条件:常温运输和保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF 需低温运输。收到货后,介质需4℃保存,溶菌酶、Benzonase和PMSF 需-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
注意:
1.每步得到的样品最好都留存少量作为SDS-PAGE分析的对照,在下面描述中就不再提醒。
2.本实验需要用到的1×PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10×PBS缓冲液而得。PBS缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌,注意防止污染。
3.GST 洗脱液的配制方法是将约80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到GST 洗脱液成分一溶液中,摇晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脱液,分装成小份放-20℃保存,每次用一管。
一、重组蛋白的表达和细菌收集
1.37℃振荡培养20mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。
2.加IPTG 到终浓度为0.1mM,30℃振荡培养3小时或22℃振荡培养8小时(或过夜)。
3.4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液,弃上清。
4.用1×PBS缓冲液重悬细菌沉淀,4℃ 5000g离心10分钟,弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。
二、细胞裂解
5.如果用本产品A型,用1mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液(1mL 1×PBS缓冲液+50μl溶液A+ 25μl 10mg/mL的PMSF溶液)重悬细菌沉淀,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,一般选1K-10K 频率处理15次,每次20秒,间隔1分钟(必需放置在冰上)。裂解物不能粘稠,否则会堵塞层析柱。
6.如果用本产品B型,在1mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液(在20mL 1×PBS缓冲液中加入所有30mg 溶菌酶干粉,溶解后分装成1mL/管,取一管使用,剩余的-20℃放置)中加入25μl 10mg/mL的PMSF溶液和1μl Benzonase,用此混合液重悬细菌沉淀后冰上放置30分钟,得到细菌裂解物。
7.将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4℃离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱,所得上清即含可溶性GST 标记蛋白。
三、层析柱的制备和GST蛋白纯化
8.摇晃将谷胱甘肽-Agarose 介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据GST蛋白产量决定,100mL菌液一般使用200μL介质即可)。下列步骤各溶液的用量均针对200μL介质而定,如果介质用量不同,各溶液用量需相应调整。
9.用5mL预冷的1×PBS缓冲液洗柱。
10.将第7 步得到的上清液(含可溶性GST标记蛋白)上柱,让重力使上柱液自然流出,收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢,所以流速一定不能快,否则结合不充分。流速一般在0.2-1mL/分钟即可。如要提高GST 标记蛋白与介质的结合效率,可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上,让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。
11.用0.5-2mL 1×PBS缓冲液洗柱,收集并保存穿透液(含杂蛋白)。
12.用0.2-1mL GST洗脱液洗柱,收集并保存穿透液(含GST 标记蛋白)。由于可能含蛋白酶污染,所以穿透液不能在4℃放置,需立即用于后续处理(如浓度测定或SDS-PAGE电泳)或-80℃长期放置。
13.对收集的2种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或SDS-PAGE分析。注意:如果不预先脱盐,则只能用Bradford法或OD 检测法(1 OD280 约等于0.5mg/mL蛋白)测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于GST的分子量为26 KD,所以在SDS-PAGE胶上,GST 标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。
附:GST柱的恢复(本试剂盒不含所需试剂)
1.用3倍体积的6M盐酸胍处理柱子10分钟。
2.用3倍体积的超纯水处理柱子10分钟。
3.用3倍体积的缓冲液一(0.5M NaCl,0.1M Tris·HCl,pH8.5)处理柱子10分钟。
4.用3倍体积的缓冲液二(0.5M NaCl,0.1M Tris·HCl,pH4.5)处理柱子10分钟。
5.再重复3-4 步两次。
6.用3倍体积的超纯水处理柱子3次。
7.用3倍体积的1×PBS缓冲液处理柱子2次。
8.堵上漏口,加3倍体积的1×PBS缓冲液待用。若长时间不用,则第7步和第8步的1×PBS改成20%的乙醇。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!