产品详情
一站式长效期SDS-PAGE套装B(分离范围2-30KD)
One-Stop Stable SDS-PAGE Pack(B)
本产品是在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)套装基础上改良而得,主要改良的地方有两处:一是配胶液的pH偏酸,二是将还原剂加入到电泳液中。
产品特点:
1.偏酸的pH使PAGE胶比常规SDS-PAGE 更加稳定,便于配预制胶,增加实验的可重复性。
2.能降低蛋白质的脱氨反应和烷基化反应,也能阻止蛋白质的二硫键再生成。
3.把还原剂整合到电泳液中,避免了蛋白质在电泳过程中重新形成二硫键,蛋白条带比常规SDS-PAGE 更加锐利。
4.可把分离胶和浓缩胶配胶液整合成一个,成分更简单。
5.更换电泳液即可用于不同大小的蛋白(A型电泳液适合20 kD以上蛋白,B型适合2-50 kD蛋白),分离多肽时不需要Tricine-SDS-PAGE。
6.即开即用,用户不需单独准备各种成分,十分方便。
7.安全,免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
8.电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
产品组成:
储存条件:常温运输和保存(SDS-PAGE上样液需-20℃保存),有效期一年。
使用方法:
一、使用本产品不需要浓缩胶,直接配制分离胶。如果使用A型电泳液(分离30 KD以上蛋白质用),最好配制10%的PAGE胶;如果使用B型电泳液(分离2-30 KD的蛋白质用),最好配制12%的PAGE胶。也可以选择其他胶浓度,但各成分用量需要按比例调整。
1.第一次使用本产品时需先配制30%丙烯酰胺溶液:在本产品提供的装有60克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146mL自备的去离子水,充分摇晃直到溶解即得200mL 30%丙烯酰胺溶液(用手大约摇10-20分钟)。
2.第一次使用本产品时还需配制30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液(简称30% AB溶液,下同): 不同实验需要加入不同比例的甲叉双丙烯酰胺。对长效期SDS-PAGE电泳,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺比例一般在19:1,因为此时PAGE胶的孔径最小,分辨率最高。制备方法是将3g甲叉双丙烯酰胺干粉加入到200mL上步配好的30%丙烯酰胺溶液中,摇晃溶解即得30%的AB溶液,该溶液最好4℃避光(可包上锡箔纸壁光)保存并在一个月内用完。30% AB溶液具有神经毒性,一定要戴手套操作。
3.新鲜配制10%的APS(过硫酸铵):按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL 去离子水的比例将去离子水加到装有硫酸铵干粉的1.5mL EP 管中,摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
4.本产品不需要配制分离胶和浓缩胶两种胶,只需要配一种连续胶。配制方法如下(以下是以配制10mL的胶的用量为例,用户自己需要根据胶的大小决定所需体积):
5.摇晃混匀后抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应,不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应)。
6.加入50μL新配制的10%APS和30μL TEMED(这是配制10mL胶的用量,配制更大体积的胶则按比例增加),迅速摇匀后倒胶。
7.在胶的液面达到顶部的时候停止灌胶并插入梳子,室温聚合30-60分钟(低温抑制聚合反应)。
8.拔出梳子,用水冲洗加样孔。
9.配制的PAGE胶可以在4℃长期放置数月,直到使用。注意:需要盖上1×长效期SDS-PAGE 配胶液,否则PAGE胶会变干而无法使用。
10.使用时,将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽加入足够量的1×长效期SDS-PAGE电泳液(A型或B型)。
?注意:长效期SDS-PAGE电泳液A型或B型均以干粉形式提供,足够配20 L 1×电泳液。配制时需将全部干粉(含多种没有充分混合的成分,必须一次性全部使用)溶解在去离子水中,并定容到1 L,得到20×长效期SDS-PAGE电泳液,使用时再用去离子水稀释成1×电泳液。20×长效期SDS-PAGE电泳液不需要调pH,可以室温放置。
11.在上槽中加入适量的1×长效期SDS-PAGE电泳液和1/200 体积(以电泳液体积为基数)的长效期SDS-PAGE还原剂并用玻璃棒搅拌混合均匀。
12.在蛋白质样品中加入5×长效期SDS-PAGE上样液(8μL样品加2μL上样液),72℃加热10分钟。注意:上样液中的一些成分在低温保存时会沉淀,所以用前需要65℃保温10分钟左右使沉淀溶解,混匀后才能使用。上样液中的2-巯基乙醇容易挥发,使用多次后用户可以在10μl样品(蛋白质样品+上样液的混合液)中补加0.5μl自备的2-巯基乙醇原液,以便使蛋白质充分变性。如果样品是蛋白质沉淀(如TCA沉淀得到的蛋白质),则需要用Tris缓冲液将其pH调到中性(可用pH试纸检测),否则残留溶剂可能会改变上样液的pH,严重影响电泳效果。
13.短暂离心,取上清液上样。上样的蛋白总量跟检测方法相关,如果用银染,可以只上样ng级别(对每条带的蛋白量而言),如果用考染,需要上样μg级别(对每条带的蛋白量而言)。
14.用150V恒压电压进行电泳,直到染料进入胶底部(在B型电泳液中,溴酚蓝的速度相当于3-5 KD的蛋白质)。注意:在长效期SDS-PAGE中的电泳速度要快于普通SDS-PAGE。在B型电泳液中的速度又快于A型电泳液。过程中,电流会降低,属于正常现象。
15.终止电泳,取出凝胶进行后续的实验处理(如染色或转膜)。注意:Western转膜需要专门的转膜液
二、如果需要更高分辨率,也可把上法配制的胶当成分离胶,并在其上再叠加4%的浓缩胶,操作如下:
16.按上面方法配制分离胶,只是倒胶后在胶面距离顶部1.5cm的时候,或者距梳子齿0.5cm时,停止灌胶。然后覆盖一层1-5 mm 厚的水,使胶顶部液面平整。室温聚合30-60分钟(低温抑制聚合反应)后,用1×长效期SDS-PAGE 配胶液洗涤凝固的胶的顶部,待用。
17.配制4%浓缩胶(参考上节第4-6 步)。倒胶后在液面达到顶部时停止灌胶,插入梳子,室温聚合30-60分钟(低温抑制聚合反应)。
18.拔出梳子,用1×电泳液(A型或B型)冲洗加样孔,后续处理接第7步。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!