产品详情
由于血液富含RNase,因此血液RNA(主要是白细胞RNA)非常容易降解,是临床分子生物学研究中的一个棘手的问题。为解决此问题,它具有下列特点:
1.能快速渗透 到新鲜抗凝血液中的有核细胞内(主要 是白细胞),抑制RNA
分子的降解。保存的血液白细胞RNA常温可放置3天,4°C可放置5天,
-20C可放置3个月。
2.操作简单, 直接将本产品和白细胞样品按比例混合即可。
3.适用于人新鲜血和哺乳动物新白细胞,不适盱陈旧血液和冻凝血液,也不适用于禽类血液和其他 动物血液。
4.重复性好, 效果跟进口同类产品相当。
5.保存的样品可直接用本公司动物RNAout提取RNA。
一、白细胞的分离和保存
1.本产 品保存全血的效果不好,故不建议用于全血的保存。必须先分离白细
胞。
2.室温1500-2000 g离心新鲜血液10-15分钟,最上层为血浆,最下层为
红细胞,中间层为膜状的、含白细胞的BuffyCoat(含白细胞多的血液此
层可能很厚)。
3.
吸出血浆后,小心将中间的白细胞层吸出( 允许污染少量红细胞),按0.5
mL白细胞加入到2.5mL(5倍体积)的本产品的比例,将两者混合。
4.如此 保存的白细胞可以在常温(不超过30°C)下放置3 天,4°C可放置5
天。如果需要-20°C放置,需要先在4C放置1天,然后在13000 g室温
离心3分钟,小心吸出浅粉红色的上清液,再将没有液体保存液的白细胞
沉淀放置在-20°C,如此可放置3个月。不能直接有液体保存液的白细胞
悬浮液放置在-20C,否则凝固形成的冰晶将会刺破白细胞膜,在凝固的
冰晶融化时,白细胞胞浆成分(含 RNA)会进入上清,在离心时丢失,离
心得到的只是细胞残骸。
5.使用时, 对4C或以上温度保存的白细胞,将1.5 mL本产品和白细胞的
混合物转移到离心管中,13000 g室温离心3分钟。小心吸出浅粉红色的
上清液,沉淀为白细胞,直接用于RNA提取。如果是在-20C保存的已经
按上步方法处理的白细胞沉淀,则直接用于RNA提取。
.二、提取RNA (本产品不提供RNA提取相关产品)
5. 建议使用Trizol或类似Trizol的动物RNAout (本公司产品)。需要注意
的是在加入异丙醇沉淀RNA时,本产品处理的样品由于盐离子浓度高会
出现两层(即两相,正常样晶会出现RNA沉淀,不会出现两层),小心去
除上清,然后加入相当于下层体积2倍的50%的异丙醇,颠倒混匀后
13000 g室温离心10分钟,RNA将沉淀在管底。再按Trizol的标准操
作流程用75%乙醇洗涤沉淀即可。
三、RNA的检测(列出步骤仅供参考,本产晶不提供相关产品)
7. RNA完整性的电泳检测:强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳,
因为非变性胶中单链RNA分子会自生折叠成各种形状,尤其不能使用
DNA.上样液,因为没有经过去RNase处理。
8. RNA 产量产率测定:将5-10 μuL RNA用TE缓冲液(pH8.2)稀释10倍
后检测其在0D260的光吸收o通过光吸收可以得出RNA浓度(1 0D260
的RNA=40 ug/ mL) ,进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA
产量/组织用量)。人血RNA产率- - 般为2-5 ug/mL .
9. RNA 纯度测定:无污染的总RNA的0D260/ 0D280一般在2.0左右(具
体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关),高于此范围则分别表
示样品可能有蛋白质污染,但一般不影响RT-PCR等反应。