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操作流程(示意图例):
产品特性:
产品应用:
磁珠法基因组DNA提取试剂盒在胃液样本提取幽门螺杆菌核酸的应用实例见下。
1.标本
快速尿素酶阳性(RUT+)胃液标本35例
2.试剂
①EmerTher磁珠法基因组DNA提取试剂盒;②QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)。
3.标本核酸提取方法
胃液预处理
取1ml的胃液加入1.5ml的离心管中,加入等量的Tris缓冲液(0.67M,pH7.4),振荡均匀,室温放置2h。13000rpm离心5min,弃上清留沉淀。
EmerTher磁珠法基因组DNA提取试剂盒:
• 经预处理的胃液沉淀中加入700μl 裂解吸附液,混和均匀,裂解细胞6min;
• 加入30μl磁珠悬浮液,振荡混合10min。用磁分离架吸附磁珠,弃上清;
• 加入800μl 洗涤液I 洗涤磁珠,吸附磁珠,弃上清;
• 再次加入800μl洗涤液I 洗涤磁珠,吸附磁珠,弃上清;
• 加入800μl 洗涤液II 洗涤磁珠,吸附磁珠,弃上清;
• 再次加入800μl 洗涤液II 洗涤磁珠,吸附磁珠,弃上清后静置3-6min,去除乙醇残留;
• 加入 100μl Nuclease-Free Water,混和均匀后洗脱5min;
• 吸附磁珠,回收含基因组DNA的洗脱液至另一离心管,进行DNA检测及后续实验。
QIAamp DNA Mini Kit按照说明书进行并改进,具体步骤如下:
• 在沉淀中加入180μl ATL和20μl 蛋白酶K,振荡混匀。将离心管置于金属浴或空气摇床中,56°C振荡2h;
• 从金属浴或空气摇床中取出离心管,进行短暂离心。在离心管中加入200μl AL,振荡混匀;
• 离心管置于金属浴中,70°C 振荡10min,将离心管短暂离心;
• 在离心管中加入200μl 新鲜的无水乙醇,振荡混匀,短暂离心;
• 将离心管中的液体全部转入到Qiagen柱中。8000rpm离心1min,弃去废液,保留柱子;
• 将柱子转入到一个新的废液收集管中,加AW1 500μl。8000rpm离心1min,弃去废液,保留柱子;
• 将柱子转入到一个新的废液收集管,加AW2 500μl。13000rpm离心3min, 弃去废液,保留柱子;
• 将柱子转入到一个新的废液收集管中,最高转速离心1min。将柱子转入到一个新的1.5ml离心管,在生物安全柜中打开盖,晾2min;
• 在柱子中加入100μl buffer AE,盖盖放置5min。8000rpm离心1min,收集洗脱出的液体(含目标DNA);
• 将收集的含DNA液体重新加入柱子中,盖上盖子放置5min。8000rpm离心1min,收集DNA,弃去柱子;
• 将收集到的DNA分装出2份,每份25μl。将提取到的DNA置-80℃冷冻保存。
4.结果
两种核酸提取方法用于临床标本检测的比较
胃液标本35例(RUT+),分别用上述两种提取方法抽提HP核酸模板,实验反应体系及反应条件见上,荧光定量检测结果如表1和图1所示。比较两种提取方法在测定HP特
异基因及内参基因的差别是否具有统计学意义,采用多元方差分析,Wilks’λ=0.96,F=0.73,P=0.49>0.05,结果表明两种核酸提取方法在检测HP特异基因及内参基因的效果相当,说明两种提取方法在临床标本中的检测能力无显著差别。
两种核酸抽提方法,EmerTher的操作过程简单、时间短,提取效率及临床标本检测能力与QIAGEN相当,在大规模临床标本筛查时应优先选择性价比高的提取方法。