产品详情
产品概述
磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力,采用固定化金属螯合层析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。 本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。 经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE 和protein arrays等下游应用。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
一年
检测方法
磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF,
WB,IP,EMSA等
适用样本
动物细胞/组织
产品应用
磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF,
WB,IP,EMSA等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。 2.实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 3.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。 4.蛋白样品中不可含EDTA。 5.蛋白样品不可以含有DTT,β-ME。 6.上样蛋白样品pH值必须低于6,蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。 7.洗涤细胞和组织是不能用PBS等磷酸盐缓冲液,要用非磷酸盐缓冲液,如50mM HEPES,Tris等或生理盐水。 8.可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。 9.每个新柱的载量约为1mg磷酸化蛋白,使用过的柱子经过再生反复使用的,载量会有下降。 10.用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集,需要离心操作时将蛋白柱置于一个50ml离心管离心即可。 11.最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。
使用方法
一、蛋白样品的准备:
以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤,其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml后直接上样即可,确保蛋白样品的pH值低于6。
可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
细胞裂解:
1. 提取液制备:
每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞,在4℃,1000×g条件下离心5-10分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞中加入500ul冷的蛋白裂解液,混匀后,在4℃条件下振荡15-40分钟。
5. 在4℃,14000×g条件下离心15分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白裂解液。
组织裂解:
1. 提取液制备:
每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取100mg组织样本剪碎,加入总蛋白提取液,用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将匀浆液在4℃条件下振荡15-30分钟。
4. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中,在4℃,14000×g条件下离心15分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白裂解液。
植物蛋白提取:
1、 裂解液制备:
每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2、 取200mg植物组织样本,去除粗筋脉络等后剪碎,置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮也可直接用裂解液置冰上研磨即可)
3、 研磨后加入500ul提取液,混匀后于一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡30分钟-1小时。
4、 在4℃,14000×g条件下离心10-15分钟。
5、 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白。
细菌蛋白提取:
1、 裂解液制备:
每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2、 在4℃, 12000×g条件下将菌液离心5min,弃上清,尽量吸干剩余液体,收集菌体。
3、 用生理盐水洗菌体2次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。
4、 按每20-50mg湿重菌体样本加入500ul裂解液,吹打混匀,4℃条件下振荡30-45分钟。
5、 在150w-300w,10s超声/10s间隔条件下冰浴超声至菌液变清。
6、 在4℃, 12000×g条件下将菌液离心15分钟,将上清移入冷的干净离心管。
7、 即得到细菌总蛋白样品。
二、柱平衡:
加入500ul洗柱液洗柱,重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。
三、上样:
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱,重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。
四、洗柱:
加入300ul洗涤液洗柱,重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。
五、洗脱:
加入500ul磷酸化蛋白洗脱液,重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱,收集洗脱液,即得到磷酸化蛋白。
六、柱保存和柱再生:
载量大幅降低后,需要再生使用的柱子,可以用1ml 0.1M EDTA溶液洗柱,然后在柱中加入20%乙醇溶液密封,置2-8℃保存。
再生使用时,加入0.1M 氯化铁溶液,浸泡蛋白柱填料1小时,即可对蛋白柱进行再生。然后用0.1M乙酸溶液洗柱即可。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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