产品详情
谷草转氨酶(GOT/AST)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格: 50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前每瓶用 4 mL 蒸馏水溶解;现用现配;
2、 标准液:20 μmol/mL 丙酮酸钠。
产品说明:
谷草转氨酶又叫天门冬氨酸氨基转移酶( 2.6.1.1),广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化可逆转氨基反应,是氨基酸代谢的重要酶。此外,GOT在心肌细胞中含量最 高,临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。GOT催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应,生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸;丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显棕红色;测定505nm吸光度的变化,即可计算GOT酶活力。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细胞或细菌样本的制备:
先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。3500g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。3500g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、标准曲线的测定:首先将标准品用蒸馏水稀释至2μmol/mL,按下表混合标准品和试剂一得到相应浓度度标准管:
3、在 EP 管中加入下列试剂
注:0μmol/mL 标准管为空白管。
三、GOT 活性计算
1. 标准曲线的绘制:以各标准溶液浓度为x轴,以?A(A标准管-A空白管)为y轴做标准曲线,得到方程y=kx+b。将(A测定管-A对照管)带入方程求x值。
2. GOT活性计算:
(1)按样本质量计算:
单位定义:每小时每g样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/g 质量)=x×(V样本+V试剂一)÷(W×V样本÷V样总)÷T=12x÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/mg prot)=x×(V样本+V试剂一)÷(Cpr×V样本)÷T=12x÷Cpr
(3)按血清体积计算:
单位定义:每小时每mL血清样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/mL)=x×(V样本+V试剂一)÷V样本÷T=12x
(4)按细胞数量计算:
单位定义:每小时每104个细胞样本催化产生1μmol丙酮酸的量为一个GOT活力单位。
GOT(U/104 cell)=x×(V样本+V试剂一)÷(V样本÷V样总×500)÷T=0.024x
V样本:吸取样本体积,0.02mL;V试剂一:吸取试剂一体积,0.1mL;V样总:吸取提取液体积,1mL;W:
样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,0.5h;500:细胞或细菌数量,500万。
实验实例:
1. 取 0.1g 兔子肝脏组织加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再按照测定步骤操作,测得 A 测定管=0.782,
A 对照管=0.488,标准曲线 y=0.4767x+0.0611,计算?A=A 测定管-A 对照管=0.782-0.488=0.294,x=(0.294-0.0611)÷0.4767=0.489,按样本质量计算酶活得:
GOT(U/g 质量)=12x÷W=12×0.489÷0.1=58.68 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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