产品详情
乙醇酸氧化酶(GO)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 6 mL 双蒸水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
产品说明:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循环中的一种酶,也是植物光呼吸代谢中的关键酶,催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,通过测定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在 324nm 有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、可调式移液枪、1mL石英比色皿、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。细胞或细菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计30min以上,调节波长至324nm,蒸馏水调零。
2. 将试剂一25℃预热15min。
3. 样本测定:1mL石英比色皿中分别加入下列试剂:
三、GO 酶活计算
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T=392.16×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义:每克组织每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO 酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×W÷V 样总)÷T=392.16×ΔA÷W
3、按细胞数量计算
酶活定义:每万细胞每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×500÷V 样总)÷T=0.784×ΔA
ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17000L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.001L;V 样:
反应中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:
样本质量,g;T:反应时间,3min;500:500 万个细胞;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 测定之前进行预实验,若吸光值 A1>1,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、 色素含量较高的样本,可在提取酶时加活性炭吸附。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,其 OD 值变化不超过 0.02。
实验实例:
1. 称取约 0.1g 三叶草组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清进行检测,测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.868-0.773=0.095,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.027-0.013=0.014,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.095-0.014=0.081,按样本质量计算酶活得:
GO 酶活(U/g 质量)=392.16×ΔA÷W=317.6496 U/g 质量。
2. 称取约 0.1g 菠菜组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清稀释 2 倍进行检测,测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.873-0.778=0.095,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.027-0.013=0.014,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.095-0.014=0.081,按样本质量计算酶活得:
GO 酶活(U/g 质量)=392.16×ΔA÷W×2(稀释倍数)=635.2992 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!