产品详情
3-磷酸甘油酸激酶(PGK)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解后待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
2、 试剂三:临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
3、 试剂四:临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
4、 试剂五:粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
5、 工作液的配制:按照蒸馏水:试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀,现用现配。
产品说明:
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内,具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP,1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸,引起 340nm 处的吸光度下降,即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
血清/血浆:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定:(在1mL石英比色皿分别加入下列试剂)
注意事项:
1. ΔA 大于 0.8 或者 A1 测定小于 0.9 时,建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时,可以延长反应时间(10min 或 15min)或增加样本体积来测定。
2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.01。
3. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
实验实例:
1、 取 0.1g 白菜加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释 4 倍,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.126-0.654=0.472,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002,ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.472-0.002=0.47,按样本质量计算酶活得:PGK(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.47÷0.1×4=6044.952 U/g 质量。
2、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释 20 倍,之后按照测定步骤操作,测得计算,ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.908-0.35=0.558,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.558-0.002=0.556,按样本质量计算酶活得:
PGK(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.556÷0.1×20=35755. 248 U/g 质量。
3、 取骆驼血清样本 100uL 按照测定步骤直接测定,测得计算,ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.966-0.907=0.059,ΔA空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.059-0.002=0.057,按液体体积计算酶活得:
PGK(U/mL)=321.54×ΔA=321.54×0.057=18.328 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!