产品详情
脂肪酶(LPS)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
标准品:临用前加入 1.435 mL 无水乙醇配成 125 μmol/mL 的油酸标准溶液,充分溶解。用前注意解冻溶解。
产品说明:
LPS又称甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和单酯)。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。LPS催化油酯水解成脂肪酸,利用铜皂法测定脂肪酸生成速率,即可计算LPS活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、甲苯、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织样本:称取约0.1g样本,加试剂一1.0 mL充分研磨,于4℃,15000rpm离心30min,取上清液待测。
血清样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至710nm,甲苯调零。
2、 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min 以上。
3、 标准溶液的稀释:将125 μmol/mL的油酸标准溶液用无水乙醇稀释为125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9μmol/mL的标准溶液待测。
4、 操作表:
反复震荡混匀;室温 4000rpm 离心 10min,小心吸取上层溶液 800μL,加入 1mL 玻璃比色皿,于 710nm 处测定吸光值。记为 A 空白管、A 测定管、A 标准管,计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。
三、LPS活性计算
1、标准曲线的绘制:以油酸标准溶液浓度为横坐标,ΔA标准为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b。
将ΔA测定带入方程,得到x(μmol/mL)。
2、酶活计算:
(1)按蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mg prot) =x×V样÷(Cpr×V样) ÷T= 0.1×x÷Cpr
(2)按样本质量计算:
活性单位定义:37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/g 质量) =x×V样÷(W×V样÷V提) ÷T= 0.1×x÷W
(3)按血清计算:
活性单位定义:37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mL 血清) =x÷T= 0.1×x
V样:加入反应体系中上清液体积,0.2mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定;T:催化反应时间,10min;W:样本质量,g;V提:提取液体积,1mL。
注意事项:
1、 甲苯有毒,实验过程中需佩戴手套和口罩。
2、 实验过程中须远离火源。
3、 当吸光度大于1时,建议将样本稀释后测量。
实验实例:
1、 取 0.1g 胰腺组织加入 1mL 试剂一匀浆研磨,取上清,之后按照测定步骤操作,测定后计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管=0.811-0.112=0.699,标准曲线 y=0.0074x,则 x=0.699÷0.0074=94.459,按样本质量计算酶活得:
LPS (U/g 质量) =0.1×x÷W=0.1×94.459÷0.1=94.459 U/g 质量。
2、 取 0.1g 红叶石楠加入 1mL 试剂一匀浆研磨,取上清,之后按照测定步骤操作,测定后计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管=0.131-0.112=0.019,标准曲线 y=0.0074x,则 x=0.019÷0.0074=2.568,按样本质量计算酶活得:
LPS (U/g 质量) =0.1×x÷W=0.1×2.568÷0.1=2.568 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!