产品详情
多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:若溶液中有晶体析出,37℃水浴溶解;
2、 试剂二:临用前加入 8 mL 蒸馏水,60℃水浴助溶;
3、 标准品:10mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943 mL 蒸馏水,配成 50 μmol/mL 的标准液。
产品说明:
多聚半乳糖醛酸酶(Ploygalacturonase,PG)属果胶酶的一种,广泛存在于植物、细菌及真菌中。其催化多聚半乳糖醛酸分解,在果实软化、花粉授粉、种子发育成熟及器官脱落等方面具有重要作用,并且病原菌在侵染宿主植物时,可分泌多聚半乳糖醛酸酶来降解宿主细胞壁,进而导致病程发展。
PG 水解多聚半乳糖醛酸生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸与 DNS 试剂反应生成在 540 nm 有特征吸收峰的棕红色物质,测定 540 nm 处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1 mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1 : 5~10 的比例(建议称取约 0.1 g,加入 1 mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,16000 g,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
细菌:先收集细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细菌数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000︰1的比例(建议 500 万个细菌加入 1 mL 提取液),冰浴超声波破碎细菌(功率 20%或 200 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 5 min);然后 4℃,16000 g,离心 10 min 取上清置于冰上待测。
液体:直接检测或用提取液稀释后检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 540 nm,蒸馏水调零。
2、 将 50 μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 10、6、4、3、2、1.5、1.2 μmol/mL 的标准溶液备用。
3、 操作表:(在 1.5mL 离心管中)
三、PG酶活计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y= kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(μmol/mL)
2、 PG 酶活的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
酶活定义:在 40℃,pH 6.0 的条件下,每毫克蛋白每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG 酶活(U/mg prot)= x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T = 0.5x÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:在 40℃,pH 6.0 的条件下,每克样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG 酶活(U/g 质量)= x×V 提取÷W÷T = 0.5x÷W
(3)按照细菌数量计算
酶活定义:在 40℃,pH 6.0 的条件下,每 104个细菌每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG 酶活(U/104 cell)= x×V 提取÷T÷细菌数量(万个)= 0.5x÷细菌数量(万个)
(4)按液体体积计算
酶活定义:在 40℃,pH 6.0 的条件下,每 mL 样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG 酶活(U/mL)= x×V 样÷V 样÷T=0.5x
V 提取:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:反应体系中样本体积,0.05 mL;T:酶促反应时间,2 h。
注意事项:
1、 样本提取上清液置于冰上待测,且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。
2、 当 A 大于 1.2 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定,并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
3、 植物果实组织建议将样本稀释 10 倍或 20 倍后再测定。
4、 若样本 ΔA 值偏小,建议延长酶促反应时间,并在计算公式中除以相应时间。
实验实例:
1、 取 0.1g 鲜梨加入 1mL 提取液冰浴匀浆后于 4℃,16000 g,离心 10 min,取上清稀释 5 倍后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.912-0.882=0.03,带入标准曲线 y=0.1127x-0.1207,计算得 x=1.337,按样
本质量计算:
PG 酶活(U/g 质量)= 0.5x÷W×5(稀释倍数)=33.43 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!