产品详情
线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:25T/12S、50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 工作液的配制:临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解,用不完的试剂 4℃可保存一周;
产品说明:
线粒体复合体Ⅲ(EC 1.10.2.2)又称CoQ-细胞色素C还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C,生成还原型细胞色素C。
与氧化型细胞色素C不同,还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1.0 mL 提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 4 ℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000 g 离心 15min。
3、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4、 在沉淀中加入 200μL 提取液,超声波破碎(功率 20%,超声 5 秒,间隔 10 秒,重复 15 次),用于复合体Ⅲ酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:在1mL玻璃比色皿中分别加入
三、复合体Ⅲ活力单位的计算
注意事项:
1、 尽量保持比色皿内反应液温度在 37℃或 25℃。可以在记录初始吸光度 A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放
入 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中准确反应 2 分钟,之后迅速取出比色皿并擦干,记录 2min时的吸光度。
2、 当测定吸光值大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后测定,计算公式中注意乘以稀释倍数。
3、 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
4、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。
5、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6、 本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。
7、 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为 50T/12S)
样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。
按样本质量计算:复合体Ⅲ(U/g 质量)=262×ΔA1÷W +52×ΔA2÷W
实验实例:
1. 取 0.1g 兔子肾脏进行样本处理,将复溶后的沉淀稀释 4 倍后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=(A2 测定-A1测定)-(A2 对照-A1 对照)=(0.548-0.481)-(0.478-0.461)=0.05,按样本蛋白浓度计算得:
复合体Ⅲ(U/mg prot)=262×ΔA÷Cpr×4(稀释倍数)=262×0.05÷2.56×4(稀释倍数)=20.47 U/mg prot。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!