产品详情
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加 6 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存两周,禁止反复冻融。
2、 试剂三:临用前加 6 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存两周,禁止反复冻融。
3、 试剂四:临用前取 1 支加入 0.3 mL 蒸馏水溶解备用,4℃保存一周。
4、 试剂五:临用前取 1 支加入 0.3 mL 蒸馏水溶解备用,-20℃分装保存一周,禁止反复冻融。
5、 试剂六:临用前加入 0.6 mL 蒸馏水溶解备用,4℃保存一周,也可按比例现用现配。
产品说明:
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP,EC2.7.1.90)是一种胞质酶,广泛存在于植物组织中,与磷酸果糖激酶一样催化果糖-6-磷酸的磷酸化,单 PEP 催化反应为可逆反应,并以焦磷酸代替 ATP,在光合作用碳代谢中起重要作用。
PFP 催化 6-磷酸果糖转化为 1,6-二磷酸果糖,它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为磷酸二羟丙酮,再由 α-磷酸甘油脱氢酶和 NADH 催化生成 3-二磷酸甘油和 NAD,340nm 处的吸光度变化反映了 PFP 的活性的高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1 g,加入 1 mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,20000 g 离心 15 min,取上清置冰上待测;
2、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液),
冰浴超声波破碎细胞(功率 300 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 3 min);然后 4℃,20000 g 离心 15 min,取上清置冰上待测;
3、液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:
三、焦磷酸:果糖 6-磷酸-1 磷酸转移酶活性的计算
注意事项:
1、每次检测样本数不宜太多以免耽误过多的酶促反应时间。
实验实例:
1、取 0.1g 豆芽进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,测得计算 A1 测定管-A2 测定管=1.041-0.963=0.078、A1空白管-A2 空白管=0、ΔA=(A1 测定管-A2 测定管)-(A1 空白管-A2 空白管)=0.078,按照样本质量计算酶活得:
PFP(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(W ×V 样÷V 提取) ÷T=53.59×ΔA÷W=41.8 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!