产品详情
谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 工作液的配制:取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入 10 mL 试剂一中溶解,现用现配,可分装后-20℃保存,避免反复冻融。
产品说明:
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成 GS/GOGAT 循环,参与氨同化的调控。
GOGAT 以 NADH 为电子供体,催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸,NADH 在 340nm吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 工作液提前配置,平衡至室温。
3、 样本测定:
三、GOGAT 活性计算
注意事项:
1、测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、最 好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3、当 A1 大于 1.5 或者 ΔA 大于 0.6(酶标仪 ΔA 大于 0.4)时,建议将样本用蒸馏水稀释后测定,当 ΔA 过小时,可以延长酶促反应时间(10min 或 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。
4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例:
1、 取 0.1g 红豆芽加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA=A1-A2=1.3015-1.0895=0.212,按样本质量计算酶活得:
GOGAT(U/g 质量)=321.5×ΔA÷W=321.5×0.212÷0.1=681.58 U/g 质量。
2、 取 0.1g 吊兰加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A1-A2=0.9753-0.966=0.0093,按样本质量计算酶活得:
GOGAT(U/g 质量)=321.5×ΔA÷W=321.5×0.0093÷0.1=29.9 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!