产品详情
超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:使用前先离心再吹打混匀。根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释 10 倍后使用,当天用完。
2、 试剂四:根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释 5 倍后使用,当天用完。
产品说明:
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细胞、细菌样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎(功率 200w,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g 4℃离心 10 分钟,取上清,置冰上待测。
2. 组织样本:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3. 血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 560nm,蒸馏水调零。
2. 测定前将试剂一、三和四 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min 以上。
3. 样本测定(按顺序在 96 孔板或加入下列试剂)
三、SOD 活性计算
1、抑制百分率的计算
抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%
尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内,越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样本;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高操作表中样本体积,同时减少相同的蒸馏水体积。
2、SOD 酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为 50%时,反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位。
3、SOD 酶活性计算:
(1)血清(浆)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷V 样×F
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F
(2)组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算:
a.按样本蛋白浓度计算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(V 样×Cpr)×F
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F
b.按样本质量计算
SOD 活性(U/g 质量)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(W×V 样÷V 样总)×F
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F
c.按细菌或细胞数量计算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(500×V 样÷V 样总)×F
=0.02×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F
V 反总:反应总体积,0.2mL;V 样:加入反应体系中的样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积 1mL;
Cpr:蛋白样本浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万;F:样本稀释倍数。
注意事项:
1、 样本和试剂二使用时在冰上放置。
2、 样本较多时,可按表格配制测定管工作液和对照管工作液(包含试剂一、(二)、三、蒸馏水),试剂四必须最后加入。
3、 反应完成后,可能有沉淀生成,混匀后测定即可。
实验实例:
1、 取 0.1g 大鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清之后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.566-0.138=0.428,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.802-0.041=0.761,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=43.8%,按样本质量计算酶活得:
SOD 活性(U/g 质量)=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W=77.94 U/g 质量。
2、 取 0.1g 稗草叶片加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清用蒸馏水稀释 4 倍后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.498-0.078=0.42,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.771-0.042=0.729,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=42.4%,按样本质量计算酶活得:
SOD 活性(U/g 质量)=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×4(稀释倍数)=294.4U/g 质量。
3、 取 20μL 羊血清蒸馏水稀释 50 倍后直接按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.467-0.049=0.418,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.771-0.042=0.729,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=42.7%,按血清/血浆体积计算酶活得:
血清(浆)SOD 活性(U/mL)=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×50(稀释倍数)=372.6 U/mL。
4、 取 1000 万细胞加入 1mL 提取液,超声破碎,离心取上清,直接按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA测定= A 测定-A 对照=0.52-0.058=0.462,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.802-0.04=0.762,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=39.4%,按细胞/细菌数量计算酶活得:
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总] ÷(1000×V 样÷V 样总)=0.0065 U/104 cell。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!