产品详情
ATP 含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:低温条件下,可能有结晶析出,放于 60℃水浴加热溶解即可,不影响使用。
2、 试剂二:临用前加入 3.5 mL 蒸馏水充分溶解,可加热促进溶解;
3、 试剂四:临用前取 1 支加入 0.2 mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;
4、 试剂五:临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
5、 试剂六:临用前取 1 支加入 0.25 mL 蒸馏水备用,用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
6、 标准品:5 mg ATP。临用前加入 0.826 mL 蒸馏水配成 10 μmol/mL 的 ATP 标准溶液,用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
7、 工作液的配制:临用前请按试剂二(mL):试剂三(mL):试剂四(mL):试剂五(mL):试剂六(mL)=0.2:0.2:0.02:0.08:0.02 的比例配制(0.52mL,约 10T 的量),现配现用。
产品说明:
ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是生物能量通货,能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。
HK 催化葡萄糖和 ATP 合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰,NADPH 和 ATP 含量成正比,以此反应 ATP 含量。
技术指标:
最 低检出限:0.0026 μmol/mL
线性范围:0.01953-3 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/ 96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、蒸馏水、冰和氯仿。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 血清(浆)中 ATP 的提取:按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL血清(浆),加入 1mL 提取液),充分震荡,10000g,4℃离心 10min;取上清液至另一 EP 管中,加入 500μL的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
2、 组织中 ATP 的提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清至另一 EP 管中,加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
3、 细胞或细菌中 ATP 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或 200W,超声 2s,停 1s,总时间 1min),10000g 4 ℃离心 10min;取上清液至另一 EP 管中,加入500μL 的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
注:以上提取过程严格控制在冰浴条件下进行。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,分光光度计用蒸馏水调零。
1、 标准溶液的稀释:取 100μL 10μmol/mLATP 标准溶液,加入 1.5mL 蒸馏水,充分混匀,配制成 0.625μmol/mL标准液使用,现用现配。(实验中每管需要 20μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
2、 加样表:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入
三、ATP 含量计算
1、 血清(浆)中 ATP 含量计算
ATP 含量(μmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准)×(V 提取+V 血清(浆))÷V 血清(浆)
=6.875×ΔA 测定÷ΔA 标准
2、 组织、细菌或细胞中 ATP 含量计算
(1) 按样本质量计算
ATP 含量(μmol/g 质量)= ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准)×V 提取÷W
=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
(2) 按细菌或细胞数量计算
ATP 含量(μmol/106 cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准)×V 提取÷5
=0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准
C 标准:标准液浓度,0.625μmol/mL;V 提取:加入的提取液体积,1mL;V 血清(血浆):血清(浆)体积,0.1mL;W:样本质量,g;5:细胞或细菌总数,5×106个。
注意事项:
1、 加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。
2、 如果吸光值大于 1.5,建议将样本用提取液稀释后进行测定。注意计算公式中乘以稀释倍数;如果吸光值过低或接近空白,建议加大样本量后进行测定,注意同步修改计算公式。
实验实例:
1、 取 0.1g 兔肺脏加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清至另一 EP 管中,加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清,置冰上按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.0873-0.065=0.0223,ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933,按样本质量计算含量得:
ATP 含量(μmol/g 质量)=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.625×0.0223÷0.2933÷0.1=0.475 μmol/g 质量。
2、 取 0.1g 稗草加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清至另一 EP 管中,加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清,置冰上按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.5351-0.4969=0.0382,ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933,按样本质量计算含量得:
ATP 含量(μmol/g 质量)=0.625×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W=0.625×0.0382÷0.2933÷0.1=0.814 μmol/g 质量。
3、 取血清 0.1mL 加入 1mL 提取液,充分震荡,10000g,4℃离心 10min;取上清液至另一 EP 管中,加入 500μL的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心 3min,取上清置冰上,使用微量石英比色皿测得计算,ΔA 测定=A2 测定-A1 测定=0.0569-0.0449=0.012,ΔA 标准=A2 标准-A1 标准=0.4368-0.1435=0.2933,按液体体积计算含量得:ATP 含量(μmol/mL) =6.875×ΔA 测定÷ΔA 标准=6.875×0.012÷0.2933=0.281 μmol/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!