产品详情
海藻糖含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、标准品:10 mg 海藻糖。临用前加 1 mL 蒸馏水,溶液浓度为 10 mg/mL,2-8℃保存两周;
2、工作液的配制:临用前取 1 瓶试剂一加入 3.5 mL 蒸馏水后,缓慢加入 14 mL 浓硫酸,不断搅拌,充分溶解,
待用。用不完的试剂 2-8℃保存一周。
产品说明:
海藻糖存在于大量有机体中,包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性,能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。
测定方法采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样本的测定等优点。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷,如果样本中含有可溶性糖,则会影响测定。本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。
技术指标:
最 低检出限:0.0055 mg/mL
线性范围:0.00625-0.4 mg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机,可调式移液器、超声破碎仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200w,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),室温静置 45min,振荡 3~5 次,冷却后,8000g,常温离心 10min,取上清。
2、 组织的处理:称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆或研碎,室温静置 45min,振荡 3~5 次,冷却后,8000g,常温离心 10min,取上清。
3、 血清(浆)的处理:吸取约 100μL 血清(浆),加入 0.9mL 提取液,充分混匀,室温静置 45min,振荡 3~5 次,
冷却后,8000g,常温离心 10min,取上清。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min,波长调节至 620nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至 95℃。
3、 标准品的准备:将标准品用蒸馏水稀释至 0.2、0.1、0.075、0.05、0.025、0.0125、0mg/mL
4、 标准品稀释表
实验中每个标准管需 60μL 标准溶液。
5、 标准曲线的建立:取 60μL 标准液和 240μL 现配的工作液混匀,95℃水浴 10 min(盖紧,防止水分散失),自然冷却至室温,取 200μL 至比色皿或 96 孔板中,在 620nm 处测吸光值 A。ΔA 标准=A 标准-A 空白,根据标准管的浓度(x,mg/mL)和吸光度 ΔA 标准(y,ΔA 标准),建立标准曲线。
6、 样本测定:取 60μL 样本和 240μL 现配的工作液混匀,95℃水浴 10 min(盖紧,防止水分散失),自然冷却至室温,取 200μL 至比色皿或 96 孔板中,在 620nm 处测定吸光度值为 A。
三、海藻糖含量计算
1. 根据标准曲线,将 ΔA 测定(y, A 测定)带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。
2. 按样本质量计算:
海藻糖含量(mg/g 质量)= V1×x÷(W×V1÷V2)= x÷W
3. 按样本蛋白浓度计算:
海藻糖含量(mg/mg prot)= V1×x÷(V1×Cpr)= x÷Cpr
4. 按细菌或细胞数量计算:
海藻糖含量(μg/104 cell)= 1000×V1×x÷(500 × V1÷V2)= 2x
5. 血清(浆)海藻糖含量计算:
海藻糖含量(mg/mL)= V1×x÷(V3×V1÷V2)= 10x
V1: 反应体系中样本体积,0.06mL;V2:提取液总体积,1mL;V3:血清、血浆体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万;1000:单位换算系数,1mg/mL=1000ug/mL。
注意事项:
如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。计算时注意同步修改计算公式。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!