产品详情
糖原含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1. 试剂一:10 mg葡萄糖。临用前加1 mL蒸馏水充分溶解,2-8℃保存两周。
2. 工作液的配制:临用前取1瓶试剂二倒入3 mL蒸馏水,缓慢倒入12 mL浓硫酸,充分溶解混匀后使用。用不完的的试剂2-8℃保存一周。
产品说明:
糖原是由葡萄糖单位构成的高分子多糖,是糖的主要的储存形式之一,主要贮存在肝和肌肉中作为备用能量,分别称为肝糖原和肌糖原。肝糖原可调节血糖浓度,当血糖升高时可在肝脏合成糖原,血糖降低时,肝糖原则分解为葡萄糖以补充血糖。因此,肝糖原对维持血糖的相对平衡十分重要。肌糖原是肌肉中糖的储存形式,在剧烈运动消耗大量血糖时,肌糖原不能直接分解成血糖,必须先分解产生乳酸,随血液循环到肝脏,通过糖异生转变为肝糖原或葡萄糖。
测定原理:蒽酮法。利用强碱性提取液提取糖原,在强酸性条件下利用蒽酮显色剂测定糖原含量。
技术指标:
最 低检出限:0.002 mg/mL
线性范围:0.003125-0.25 mg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机,可调式移液器、微量比色皿/96孔板、浓硫酸(不允许快递)和蒸馏水。
操作步骤:
一、 样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1﹑细胞或细菌:收集500~1000 万细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;加入0.75mL提取液超声波破碎细菌或细胞(功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);转移至10mL试管中,置于沸水浴中煮沸20min(盖紧,防止水分散失),隔5min振摇试管1次,使充分混匀;取出试管冷却后,用蒸馏水定容到5mL,混匀,8000g25℃离心10min,取上清液待测。
2﹑组织:称取0.1~0.2g样本,置于10mL试管中;加入0.75mL提取液,置于沸水浴中煮沸20min(盖紧,防止水分散失),隔5min振摇试管1次,使充分混匀;待组织全部溶解后,取出试管冷却后,用蒸馏水定容到5mL,混匀,8000g 25℃离心10min,取上清液待测。
二、 测定步骤
1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至620nm,分光光度计蒸馏水调零。
2.试剂一稀释:取10μL 10mg/mL葡萄糖标准液,加入990μL蒸馏水,充分混匀,配制成0.1 mg/mL葡萄糖溶液备用,现用现配。(实验中每管需要60μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3.加样表(在 EP 管中反应):
混匀,沸水浴10min(盖紧,防止水分散失),冷却,取200μL转移至微量比色皿或96孔板中,于620nm波长处,分别读取空白管、标准管和测定管吸光度,分别记为A1、A2 和A3。(空白管和标准管只要测1-2次)
三、 糖原含量的计算
1、 按照样本质量计算
糖原(mg/g 质量)= (C标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) ÷1.11= 0.450×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W
2、 按照样本蛋白浓度计算
糖原(mg/mg prot)= (C标准×V1)×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷(V1×Cpr) ÷1.11=0.09×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷Cpr
3、按照细菌或细胞数量计算
糖原(mg/104 cell)= (C标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(细菌或细胞数量×V1÷V2) ÷1.11
= 0.450×(A3-A1)÷(A2-A1)÷细菌或细胞数量
1.11:是此法测得葡萄糖含量换算为糖原含量的常数,即111μg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100μg糖原用蒽酮所试剂显示的颜色;C标准:标准管浓度,0.1mg/mL;V1:加入反应体系中待测样本体积,0.06mL;V2:样本总体积,5mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;细菌或细胞数量:以104为单位,万个。
注意事项:
如果吸光值大于1.4,建议将样本用蒸馏水稀释后进行测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!