产品详情
胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1.试剂一:用时加入 20 mL 提取液溶解;
2.试剂二:用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用;
3.试剂三:用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用;
4.工作液配制:将试剂一、试剂二、试剂三按 85:1:1 的比例混合,现用现配。
产品说明:
ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应,在 340nm 下测定 NADPH 浓度的增加,即可反映 ICDHc 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 按下表步骤加样:
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英 96 孔板中,加样本的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1;迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中,准确反应 2 分钟(酶标仪有控温功能,可以将温度调至 37℃);迅速取出比色皿并擦干,记录 2 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A2-A1。
三、ICDHc 活力单位的计算
注意事项:
1. 若 A2-A1 大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A2-A1 小于 0.5,可提高检测灵敏度。若初始值 A1 大于 0.5可尝试将酶液用提取液稀释。
2. 实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活;工作液 37℃水浴放置。
3. 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4. 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
实验实例:
1. 取 0.1g 稗草,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g 4℃离心 10min,取上清,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.2285-0.2139=0.0146,按样本质量计算酶活得:ICDHc(U/g 质量)=1608×ΔA÷W=234.768 U/g 质量。
2. 取 0.1g 小鼠肾组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 8000g 4℃离心 10min,取上清稀释 10 倍,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.5989-0.1263=0.4726,按样本质量计算酶活得:ICDHc(U/g 质量)=1608×ΔA÷W×10=75994.08 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!