产品详情
蔗糖磷酸化酶(SP)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 6 mL 蒸馏水,充分混匀。4℃可以保存 4 周。
2、 试剂四:临用前取 1 支加入 0.6 mL 蒸馏水,充分混匀。分装后-20℃保存,避免反复冻融,可以保存 2 周;
3、 试剂五:粉剂置于瓶内玻璃管中。临用前加入 10 mL 蒸馏水,充分混匀。-20℃分装保存,避免反复冻融,可以保存 4 周;
4、 试剂六:临用前取 1 支加入 1 mL 蒸馏水,充分混匀(可做 100T,为保证试剂盒使用时间,故多给一支);可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃可以保存 2 周;临用前按试剂六:蒸馏水=1:1 的比例稀释试剂六,现用现配;
5、 试剂七:临用前取 1 支加入 0.7 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存,避免反复冻融,-20℃可以保存 2 周;临用前按试剂七:蒸馏水=1:1 的比例稀释试剂七,现用现配。
产品说明:
蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP)(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,属于糖基水解酶 13 家族,是一种催化转移葡萄糖苷键的酶,能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成 1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖为供体,多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体,催化合成各种糖苷。SP 能够催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖,在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP+生成 NADPH,导致 340nm 光吸收值增加。通过 340nm 吸光度的增加速率来反映 SP 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器、微量石英比色皿/96孔 UV 板、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5-10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min ,取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104 个):提取液体积(mL)为 500-1000︰1 的比例(建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 200 W,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 10000 g,4℃,离心 10 min ,取上清置于冰上待测。
3、液体:直接检测。若液体浑浊可离心后取上清测定。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 试剂一 37℃预热 10min。
3、 操作表:
二、SP 活性计算:
注意事项:
1、如果测定吸光值 A>1,建议用提取液稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值,建议增加样本量后再进行测定。
实验实例:
1、 称取 0.1 g 土豆,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,10000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作,计算 ΔA=(0.4070-0.3117)-(0.0956-0.0949)=0.0946。计算活性:
蔗糖磷酸化酶酶活(U/g 质量)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10 9÷(V 样÷V 样总×W)÷T =760.44 U/ g 质量
2、 称取 0.1 g 黑米,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,10000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清置于冰上待测。使用微量石英比色皿按照测定步骤操作,计算 ΔA =(0.4559-0.3546)-(0.0956-0.0949)=0.1006,计算活性:
蔗糖磷酸化酶酶活(U/g 质量)=ΔA÷ε÷d×V 反总×10 9÷(V 样÷V 样总×W)÷T =808.67 U/ g 质量
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!