产品详情
线粒体复合体Ⅰ活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 1 mL 丙酮;
2、 试剂三:溶于 1 mL 丙酮,可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用,现用现配;
3、 试剂四:临用前加入 2 mL 蒸馏水,现配现用;
4、 工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三 1:1 混合,现配现用。
产品说明:
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板(UV 版)、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1.0 mL 提取液,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
2. 4℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000 g 离心 15min。
3. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4. 在沉淀中加入 400μL 提取液,超声波破碎(功率 20%,超声 5 秒,间隔 10 秒,重复 15 次),用于复合体Ⅰ酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)预热15min。
3. 操作表:在微量石英比色皿/96孔板(UV版)中分别加入
三、复合体Ⅰ活力单位的计算
注意事项:
1. 为保证实验结果的准确性,需先取 1-2 个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于 1.5),可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若 ΔA 大于 0.4,需将样本稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数);若 ΔA 偏小,则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4. 本试剂盒试剂足够完成 100 管反应。
5. 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为 100T/48S)
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肺进行样本处理,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得 ΔA1=A1-A2=1.4505-1.2163=0.2342,ΔA2=A1-A2=1.499-1.398=0.101,按样本质量计算得:
上清中复合体 I 活性(U/g 质量)=1608×ΔA1÷W=1608×0.2342÷0.1=3765.936 U/g 质量
沉淀中复合体 I 活性(U/g 质量)=643×ΔA2÷W=643×0.101÷0.1=649.43 U/g 质量
则复合体 I(U/g 质量)=1608×ΔA1÷W +643×ΔA2÷W=1608×0.2342÷0.1+643×0.101÷0.1=4415.366 U/g 质量。
2、 取 0.1g 玉兰进行样本处理,上清液和沉淀都稀释 4 倍,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得 ΔA1=A1-A2=1.3518-1.3348=0.017,ΔA2=A1-A2=1.4269-1.4115=0.0154,按样本质量计算得:
上清中复合体 I 活性(U/g 质量)=1608×ΔA1÷W×4(稀释倍数)=1608×0.017÷0.1×4=1093.44 U/g 质量
沉淀中复合体 I 活性(U/g 质量)=643×ΔA2÷W×4(稀释倍数)=643×0.0154÷0.1×4=396.088 U/g 质量
则 复 合 体 I( U/g 质 量 ) =1608×ΔA1÷W×4( 稀 释 倍 数 ) +643×ΔA2÷W×4( 稀 释 倍 数 )
=1608×0.017÷0.1×4+643×0.0154÷0.1×4=1489.528 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!