产品详情
羧酸酯酶(CarE)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前先加入 1.25mL 无水乙醇,震荡使其大部分溶解,再加入 8.75mL 试剂三,震荡至充分溶解;
2、 试剂二:临用前取 16 mL 试剂三加入试剂二瓶中震荡使其充分溶解,临用前配制。本试剂溶解后为淡黄色,且在常温下不稳定,建议根据样本量取适当配好的试剂二置于冰上待用,剩余试剂分装后置于-20℃保存,禁止反复冻融。
产品说明:
哺乳动物 CarE,也称脂族酯酶(aliesterase),广泛分布于组织和器官,属于丝氨酸水解酶家族。CarE 催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解,但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢,并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关,有机磷农药可结合并且抑制 CarE 活性。
CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固蓝显色;在 450nm 光吸收增加速率,计算 CarE 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液,超声波破碎细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);然后15000rpm,4℃,离心10min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤),置于冰上待检。
组织:按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000rpm,4℃,离心10min,取上清(若上清不够澄清,建议重复上述离心步骤),置于冰上待检。
血清:直接测量。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至450nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一置于37℃水浴中预热10 min以上,试剂二在检测过程中需置于冰上待用。
3、 在微量玻璃比色皿或96孔板中进行如下操作:
将上述试剂按照先后顺序分别加入微量比色皿或 96 孔板中,加入试剂一即开始计时,迅速混匀后,测定第 10s的吸光值记为 A1 空和 A1 测,37℃条件下准确反应 5min,测定 310s 的吸光值,记为 A2 空、A2 测。计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空,ΔA 测定管=A2 测-A1 测。(空白管只需做 1~2 次)
(注意:本试剂盒反应时应保持 37℃的环境,一般酶标仪有控温功能,可直接设置成 37℃,待温度上升至 37℃后即可开始试验;若用没有控温装置的分光光度计,则可以用恒温水浴锅辅助反应,具体操作如下:将上述试剂按照先后顺序分别加入比色皿中,加入试剂一即开始计时,迅速吹打混匀,记录第 10s 的吸光值 A1,迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中准确反应 5min,之后迅速取出比色皿并擦干,记录 310s 时的吸光度 A2,计算ΔA=A2-A1。)
三、CarE 活性计算
注意事项:
1、 试剂二为-20℃储存试剂,在常温下不稳定,一般常温放置 2-3 小时即可明显发现液体由浅黄色变为浅褐色(液体变褐色视为变质,不可用)。建议试验前根据样本量计算所需试剂二的用量,在试剂二溶解后,留取所需用量置于冰上待用,剩余试剂可分装后-20℃储存。
2、 动物组织样本一般稀释 8 倍或更大稀释倍数后进行操作测定。
3、 当吸光值大于 1 时,建议将样本稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。
4、 为保证反应时间的准确性,建议逐一比色;如想用 96 孔板对多样本同时检测,建议使用排枪,且一次最多 8个或 12 个孔(8 道排枪或 12 道排枪)。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清用蒸馏水稀释 32 倍后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空=0.148-0.122=0.026,ΔA 测定管=A2 测-A1 测=0.457-0.118=0.339,按样本质量计算酶活得:
CarE 酶活(U/g 质量)=8×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×F=8×(0.339-0.026)÷0.1×32=801.28 U/g 质量。
2、 取 0.1g 小鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清用蒸馏水稀释 8 倍后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 空白管=A2 空-A1 空=0.148-0.122=0.026,ΔA 测定管=A2 测-A1 测=0.28-0.124=0.156,按样本质量计算酶活得:
CarE 酶活(U/g 质量)=8×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ×F=8×(0.156-0.026)÷0.1×8=83.2 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!