产品详情
NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 360 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;
2、 试剂三:临用前加入 327 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明:
MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板(UV 板)、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清,按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.05g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计/酶标仪提前预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、试剂一37℃预热15min。
3、样本测定:
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中,充分吸打混匀后立即在 340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,尽量保持反应温度为 37℃。计算 ΔA=A1-A2。记录 ΔA 测定、ΔA 空白。(空白管测 1-2 管即可)
三、NAD-MDH活力单位的计算
注意事项:
1、 粗酶液的提取必须在 0℃-4℃中操做完成,以防止酶变性失活。
2、 实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活。
3、 使用光径为 1cm 的微量石英比色皿时当初始读值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。使用 96 孔 UV板时当初始读值小于 0.4 或者 ΔA 大于 0.3 时建议稀释后测量。
4、 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小,不推荐用 96 孔 UV 板同时测多个样本。
实验实例:
1、 取 0.05g 大鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8484-0.3068=0.5416,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045,
按样本质量计算酶活得:
NAD-MDH(U/g 质量)=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W=6431×0.5371÷0.05=69082 U/g 质量。
2、 取0.05g柳树叶加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1 测定-A2 测定=0.7796-0.6917=0.0879,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045,按样本质量计算酶活得:
NAD-MDH(U/g 质量)=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W=6431×0.0834÷0.05=10727 U/g 质量。
3、 取 5μL 血浆直接按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8194-0.7959=0.0235,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.7628-0.7583=0.0045,按血清/血浆体积计算酶活得:
NAD-MDH(U/mL)=6431×(ΔA 测定-ΔA 空白)=6431×0.019=122 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!