产品详情
NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1.试剂二:临用前加入 500 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;
2.试剂三:临用前加入 600 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明:
MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,NADP-MDH主要存在于真核细胞中。
NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/ 96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 酶标仪/紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一置于37℃水浴中预热15min以上(保证无沉淀)。
3、 操作表
将上述试剂按顺序加微量石英比色皿/石英 96 孔板中,充分吹打混匀后立即记录 340nm 波长下初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算 ΔA 空白=A1 空白-A2 空白,ΔA 测定=A1 测定-A2 测定,计算 ΔA=ΔA测定-ΔA 空白。(空白管测 1-2 管即可)
三、NADP-MDH活力单位的计算
注意事项:
1、 样本的提取必须在 0℃-4℃中操做完成,以防止酶变性失活。
2、 实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂一 37℃放置。
3、 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小,不推荐用 96 孔 UV 板同时测多个样本。
4、 用分光光度计时,当初始值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时,建议稀释后测量。
实验实例:
1、 取 0.1g 心脏组织加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA测定管=A1 测定-A2 测定=0.7173-0.6399=0.0774,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.6583-0.6562=0.0021,ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.0753,按样本质量计算酶活得:
NADP-MDH(U/g 质量)=6430×ΔA÷W=6430×0.0753 ÷0.1=4841.79 U/g 质量。
2、 取 5μL 血清直接按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.6934-0.6854=0.008,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.6583-0.6562=0.0021,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0059,按血清/血浆体积计算酶活得:
NADP-MDH(U/mL)=6430×ΔA=6430×0.0059=37.937 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!