产品详情
柠檬酸合酶(CS)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂五:临用前加入 500 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;
2、 试剂六:临用前加入 1.5 mL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明:
CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使DTNB转变成黄色的TNB,在412nm处有特征吸光值。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1) 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL提取液和10μL试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2) 将匀浆液600g,4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
3) 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS。
4) 在沉淀中加入200μL试剂一和2μL试剂二,反复吹打充分混匀,用于CS测定,并用于蛋白浓度测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、 试剂三置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热10min左右(保证无沉淀)。
3、 操作表:在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入
将上述试剂按顺序加入微量玻璃比色皿/96孔板中,加试剂六的同时开始计时,记录412nm波长下10秒时的初始吸光度A1,之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中准确反应2分钟(96孔板放入恒温箱中);迅速取出比色皿并擦干,412nm下记录2分10秒时的吸光度A2,并计算测定管的ΔA1=A2-A1,对照管的ΔA1’=A2-A1,ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三、CS 活性计算
A、按微量玻璃比色皿计算:
按样本蛋白浓度计算
单位的定义:37℃或25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样本)÷T=1050×ΔA÷Cpr
ε:TNB的消光系数,13.6×10-3mL/(nmol·cm);V反总:反应体系总体积,0.2mL;d:比色皿光径,1cm;V样本:加入的样本体积,0.007mL; T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
B、按96孔板计算:
将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
注意事项:
1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最 好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
4、用 96 孔板测定时,根据测定管数量配制测定管工作液(试剂三、四、五、六)和对照管工作液(试剂三、四),因通过单位时间内吸光值变化计算酶活,不推荐同时测多个样本。
5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6、附:使用样本鲜重计算公式:
A、按微量玻璃比色皿计算
单位的定义:37℃或25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS上清(U/g 质量)=ΔA上清÷(ε×d)×V反总÷(W×V样本÷V提取)÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀(U/g 质量)=ΔA沉淀÷(ε×d)×V反总÷(W×V样本÷V样总)÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS(U/g 质量)=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清:上清测定值;ΔA沉淀:沉淀测定值;ε:TNB的消光系数,13.6×10-3mL/(nmol·cm);V反总:反应
体系总体积,0.2 mL;d:比色皿光径,1cm;V样本:加入的样本体积,0.007mL;V提取:提取液体积,1.01mL;V
样总:溶解沉淀的总体积,0.202mL;T:反应时间,2min;W:样本质量,g。
B、按96孔板计算
将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠心脏样本加入 1mL 提取液和 10μL 试剂二进行匀浆研磨,取上清后再离心,取上清,取沉淀后加入 200μL 试剂一和 2μL 试剂二,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测吸光度后计算上清中:ΔA1=A2-A1 =1.4577-0.8015=0.6562,ΔA1’=A2’-A1’=0.7842-0.7331=0.0511,ΔA 上清=ΔA1-ΔA1’=0.6051;沉淀中:ΔA1=A2 -A1 =0.4166-0.1303=0.2863,ΔA1’=A2’-A1’=0,ΔA 沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.2863,按样本质量计算酶活得:CS(U/g 质量)= CS 上清+CS 沉淀=1061×ΔA 上清÷W+212×ΔA 沉淀÷W
= 1061×0.6051÷0.1+212×0.2863÷0.1=7027.067 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!