产品详情
丙酮酸脱羧酶(PDC)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:内含不溶物,使用前摇匀;
2、 试剂一的配制:临用前配制,将试剂一 B、试剂一 C 加入到试剂一 A 中并充分溶解。-20℃分装保存,可保存 1 个月。
3、 试剂二 B:临用前加入 0.3mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃分装保存两周。
4、 试剂二 C:临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃分装保存两周。
5、 试剂二的配制:临用前配制,取 1.305mL 试剂二 A、0.12mL 试剂二 B、0.075mL 试剂二 C 混合(共 1.5mL,约 75T),现用现配。
产品说明:
PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。
PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/ 96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。16000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,冰上充分研磨。16000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、操作步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 根据样本数取适量试剂一、试剂三37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴提前预热30min.
3、 操作表:
迅速混匀后于 340nm 比色,记录 10s 和 70s 的吸光值,测定管的记为 A1 和 A2,空白管的记为 A3 和 A4,计算 ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)。(空白管只需做 1-2 次)
三、PDC活性计算
注意事项:
1、 实验时,试剂二和样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入
37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最 好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。使用 96 孔板测定时不推荐同时测多个样本。
4、如果 1 分钟变化值较小可延长反应时间,同时注意修改计算公式。
实验实例:
1、 取 0.1g 绿萝叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.9557-0.9299)-(0.7363-0.7301)=0.0196,按样本质量计算酶活得:
PDC(U/g 质量)=1.6×ΔA÷W=1.6×0.0196÷0.1=0.3136 U/g 质量。
2、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清稀释 40 倍后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.703-0.468)-(0.7363-0.7301)=0.2288,按样本质量计算酶活得:
PDC(U/g 质量)=1.6×ΔA÷W=1.6×0.2288÷0.1×40(稀释倍数)=146.432 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!