产品详情
乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将粉剂一倒入提取液中,溶液为悬浊液,使用前需摇匀;
2、 试剂二:临用前取 1 支试剂二加入 1mL 蒸馏水,可以-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融。1 支即可做 100T,为延长试剂盒使用时间,遂多给一支。
产品说明:
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶,催化乙醇与乙醛可逆转换,在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成,肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH在340nm处有吸收峰,而NAD+没有;测定340nm 吸光度下降速率,来计算ADH活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
2、 细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);16000g,4℃离心 20min,取上清液置冰上待测。
3、血清等液体:直接测定。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一在25℃水浴中保温30min以上。
3、 空白管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL蒸馏水、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂
三,迅速混匀后于340nm测定吸光值变化,分别记录15s和75s时吸光值,分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。(空白管只需做1~2个)
4、 测定管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL上清液、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三,迅速混匀后于340nm测定吸光值变化,分别记录15s和75s时吸光值,分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。
三、ADH活性计算
注意事项:
上清液蛋白质浓度需要另外测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 大鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA 测定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301,按样本质量计算酶活得:
ADH (U/g 质量) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 质量。
2、 取马血清直接检测,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA 测定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333,按液体体积计算酶活得:
ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL。
3、 取小鼠血浆直接检测,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA 测定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288,按液体体积计算酶活得:
ADH (U/mL) =1.61×(ΔA 测定管–ΔA 空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!