产品详情
NADP-苹果酸酶(NADP-ME)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:用时加入 10 mL 提取液充分溶解备用;
2、 试剂三:用时加入用时每支加 1 mL 双蒸水充分溶解备用;
3、 试剂四:用时每支加 500 μL 双蒸水充分溶解备用;
4、 工作液:在 7.5 mL 试剂二中加入 1 mL 试剂三和 0.5 mL 试剂四,可以根据比例现用现配。
产品说明:
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NADP-ME催化NADP+还原成NADPH,在340nm下测定NADPH增加速率。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细菌、细胞或组织样本的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、 血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中保温15min左右。
3、 操作表:
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中混匀,在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种),340nm波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。
三、NADP-ME 活性计算
注意事项:
1、 若A2-A1大于0.5,需将样本用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。
2、 实验时,试剂三、试剂四和样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。
3、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用96孔板做时尽量保持反应温度在37℃或25℃。
4、 最 好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。用96孔板做时尽量做到样本反应时间一致。
5、 如果ΔA<0.01,可将反应时间延长5分钟或10分钟。
实验实例:
1、 取 0.1g 肝加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.8753-0.6389=0.2364,按样本质量计算酶活得:
NADP-ME(U/g 质量)=4823×ΔA÷W=4823×0.2364÷0.1=11401.572 U/g 质量。
2、 取 0.1g 蒜加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.1305-0.1081=0.0224,按样本质量计算酶活得:
NADP-ME(U/g 质量)=4823×ΔA÷W=4823×0.0224÷0.1=1080.352 U/g 质量。
3、 取 10μL 马血清直接按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A2-A1=0.0763-0.0738=0.0025,按血清/血浆体积计算酶活得:
NADP-ME(U/mL)=4823×ΔA=4823×0.0025=12.0575 U/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!