产品详情
硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂三:临用前取 1 支加入 1.667 mL 蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃保存 1 周。
2、 试剂四:临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释 10 倍后使用。
产品说明:
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似,催化 GSSG 还原生成 GSH,是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。
TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+,TNB 在 412nm 有特征吸收峰,但还原型谷胱甘肽与 DTNB同样能反应生成 TNB,因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽,通过测定 412nm 波长处TNB 的增加速率,即可计算 TrxR 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上待检测。
2、细菌、细胞:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min),然后 10000rpm,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
注:测定前将上清液与试剂四以50:1的体积比混匀(即取100μL上清液加入2μL试剂四混合)37℃水浴30min后至冰上。
二、测定步骤
1. 分光光度计或酶标仪预热 30min 后,调节波长到 412nm,用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)预热 30min。
3. 空白管:取微量玻璃比色皿或 96 孔板,加入 20μL 试剂二,20μL 试剂三,160μL 试剂一,迅速混匀后于 412nm测定 10s 时的吸光度,37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度记为 A1 和 A2。计算 ΔA 空白管=A2-A1。
4. 测定管:取微量玻璃比色皿或 96 孔板,加入 20μL 试剂二,20μL 试剂三,140μL 试剂一,20μL 上清液,迅速
混匀后于 412nm 测定 10s 时的吸光度,37℃水浴 5min 迅速拿出测量 412nm 下的吸光度,记为 A3 和 A4。ΔA 测定管=A4-A3。
三、TrxR活性计算
注意事项:
1、 哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时,一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右;测定过程操作须迅速。
2、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约 0.1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例:
1、 取 0.1g 月季花朵加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆,10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.8600-0.8177=0.0423,ΔA 空白管=A2-A1=0.0792-0.0727=0.0065,按样本质量计算酶活得:
TrxR(U/g 质量)=147×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W=5.26 U/g 质量。
2、 取 0.1g 肝脏加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆,10000rpm,4℃离心 10min,取上清稀释 4 倍置冰上,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.8538-0.2102=0.6436,ΔA 空白管=A2-A1=0.0792-0.0727=0.0065,按样本质量计算酶活得:
TrxR(U/g 质量)=147×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×4(稀释倍数)=3746.148 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!