产品详情
谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂三:临用前加入 2.0 mL 蒸馏水,混匀。
产品说明:
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,GR 是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR 还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。
GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+;NADPH 在 340nm 有特征吸收峰,相反 NADP+在该波长无吸收峰;通过测定 340nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、移液器、匀浆器/研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称约 0.1g 组织,加入 1.0 mL 试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清液,待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 340nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min 以上。
3. 空白管:取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 10μL 试剂二,20μL 试剂三,170μL 试剂一,于 340nm 测定 10s和 190s 吸光度,记为 A 空 1 和 A 空 2。
4. 测定管:取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 10μL 试剂二,20μL 试剂三,20μL 上清液,150μL 试剂一,于 340nm测定 10s 和 190s 吸光度,记为 A 测 1 和 A 测 2。
注:样本测定 10s 时吸光度后,将比色皿放入 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)水浴,3min 后拿出,吸打混匀,立即测定 190s 时的吸光度。
三、GR 活性计算
注意事项:
1、 样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;
2、 试剂三须现配现用,配置完后,置于冰上;
3、 测定前须先用 1-2 个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2-5 倍;
4、 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约 0.1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。
实验实例:
1、 取 0.1g 桃树叶片加入 1.0 mL 试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清液稀释 4 倍后按测定步骤检测,用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2=1.0765-0.626=0.4505,ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2=0,按样本质量计算酶活得:
GR 酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×4(稀释倍数)=9.66 U/g 质量。
2、 取 0.1g 大鼠肝脏加入 1.0 mL 试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min,取上清液稀释 8 倍后按测定步骤检测,用微量石英比色皿测得 ΔA 测定管=A 测 1-A 测 2=0.9916-0.5632=0.4284,ΔA 空白管=A 空 1-A 空 2=0,按样本质量计算酶活得:
GR 酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W×8(稀释倍数)=18.37 U/g 质量
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!