产品详情
γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加 6 mL 蒸馏水充分震荡溶解,用不完的试剂-20℃分装保存,禁止反复冻融;
2、 试剂三:临用前加 5 mL 蒸馏水充分震荡溶解;
3、 试剂五:临用前加入 12 mL 蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入 400 μL 浓硫酸(自备),边加边搅拌;
4、 标准品:1 μmol/mL磷标准溶液。临用前将标准液用蒸馏水稀释成0.1 μmol/mL磷标准溶液。
产品说明:
GCL(glutamate cysteine ligase)是GSH合成的限速酶,GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同时ATP去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出GCL活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min,调节波长到660nm,蒸馏水调零。
2、 加样表:
三、GCL活性计算
注意事项:
1、 样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,以免影响其活力。如果是匀浆液,避免反复冻融。
2、 样本测定前先取 1-2 个样做预实验,如吸光值大于 1,应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数,哺乳动
物组织和血液一般稀释 3-5 倍。
3、 细胞中 GCL 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GCL 的提取时可加试剂一(或生理盐水)后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
4、 试剂三配制完成后,请一周内使用完。
5、 试剂五配制过程中,可能会产生黑色固体,其不影响结果,注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色,若为蓝色则已污染,不可再使用。
6、 测定吸光值时请于水浴后 10-40 分钟内测完。
实验实例:
1、 取 0.1g 三叶草加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上按照测定步骤操作,用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.784-0.415=0.369,ΔA标=A标准管-A空白管=0.371-0.042=0.329,按样本质量计算酶活得:
GCL(U/g 质量)=0.0544×ΔA 测÷ΔA 标÷W=0.61 U/g 质量。
2、 取 0.1g 柳树加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上按照测定步骤操作,用 96孔板测得计算 ΔA 测=A 测定管-A 对照管=0.530-0.366=0.164,ΔA 标=A 标准管-A 空白管=0.371-0.042=0.329,按样本质量计算酶活得:
GCL(U/g 质量)=0.0544×ΔA 测÷ΔA 标÷W=0.271 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!