产品详情
γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 工作液(在试剂一瓶中配制):临用前配制,把试剂二倒入试剂一瓶中,充分溶解(室温过低时可以 40℃水浴促进溶解);然后把试剂三倒入试剂一瓶中,混匀后室温保存。
产品说明:
γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。
γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:称取约 0.1g 样本,加提取液 1.0 mL 充分研磨,于 4℃,10000rpm 离心 15min,取上清液待测。
3、血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至405nm,蒸馏水调零。
2、 工作液置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min以上(保证无沉淀)。
3、 样本测定:
三、γ-GT活性计算
注意事项:
培养细胞中γ-GT活性测定时,细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。
实验实例:
1、 取 0.1g 肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,于 4℃,10000rpm 离心 15min,取上清液稀释 4 倍按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定管=A 测 2-A 测 1=2.088-0.638=1.45,ΔA 空白管=A 空 2-A 空 1=0.435-0.425=0.01,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=1.45-0.01=1.44,按样本质量计算酶活得:
γ-GT(U/g 质量)=0.845×ΔA÷W×4(稀释倍数)=48.67 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!