产品详情
非蛋白质巯基含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液的配制:将提取液一和提取液二按体积比 1:1 的比例混合配制,按照样本数量配制并在当天用完;
2、 试剂二:临用前加入 2 mL 无水甲醇充分溶解备用;
3、 标准品:10 mg 半胱氨酸,临用前加入 1.65 mL 提取液溶解为 50 μmol/mL 的半胱氨酸标准溶液。
产品说明:
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功能,对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。
巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在412nm处有最 大吸收峰。
技术指标:
最 低检出限:0.0061 μmol/mL
线性范围:0.00625-0.8 μmol/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、离心机、恒温水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、甲醇、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1.动物、植物组织:称取约 0.1g,加入 1mL 的提取液,制备成 10%的匀浆,10000g,常温离心 10min,取上清待测。
2.细胞或细菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min)然后 10000g,常温离心 10min,取上清置冰上待测。
3.血清(浆),培养液:向 0.1mL 血清(浆)或培养液中加入 1mL 提取液,10000g,常温离心 10min,取上清待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2. 标准品的制备:将50μmol/mL标准溶液用提取液稀释至0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL的标准液,现用现配。
3. 操作表
三、计算公式
1. 标准曲线的绘制:
以标准液浓度为x轴,ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定代入公式得到x(μmol/mL)。
2. 非蛋白质巯基含量计算:
(1)按样本质量计算
非蛋白质巯基含量(μmol/g 质量)=x×V提取÷W=x÷W
(2)按血清、培养液体积计算
非蛋白质巯基含量(μmol/mL)=x×(V提取+V液体)÷V液体=11×x
(3)按细胞数量计算
非蛋白质巯基含量(μmol/104 cell)=x×V提取÷500=0.002×x
V提取:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr,样本蛋白浓度,mg/mL;500:500万个细胞;V液体:血清(浆)或培养液体积,0.1mL。
注意事项:
如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.457-0.061=0.396,带入标曲 y=2.4988x+0.0666,得出 x=0.1318,按样本质量计算含量得:
非蛋白质巯基含量(μmol/g 质量)=x÷W=0.1318÷0.1=1.318μmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!