产品详情
柠檬酸(CA)含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂三:为易挥发试剂,用完后尽快密封,-20℃保存;
2、 试剂四:临用前取 1 支加入 1.5 mL 试剂一,充分溶解,用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。
3、 标准品:1 mmol/L 柠檬酸标准液。临用前用蒸馏水稀释成 250 μmol/L 柠檬酸标准液(将 25μL1 mmol/L柠檬酸标准液和 75μL 蒸馏水混合即可),现用现配。
产品说明:
技术指标:
最 低检出限:52.09 μmol/L
线性范围:62.5-6000 μmol/L
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、液体样本中柠檬酸提取:取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。
2、组织中柠檬酸提取:称约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。
3、线粒体中柠檬酸提取:称约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,600g,4℃离心 5min;取上清至另一 EP 管中,11000g,4℃离心 10min,弃上清(此上清液可用于细胞质 CA 含量测定);向沉淀中加试剂二 200μL,以及试剂三 2μL,充分悬浮溶解,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长到545nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。
3、 操作表(按下表在1.5mLEP管/96孔板管中加入相应试剂):
三、柠檬酸含量计算
注意事项:
1、样本处理等过程均需要在冰上进行。
2、试剂五为易致癌物质,实验过程中,需佩戴手套,避免试剂五溅到皮肤上。
3、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定,如需测定蛋白含量,需另取组织进行测定。
4、若反应30min后有明显的黑色小颗粒,属于正常现象,需将样本稀释后再测。
5、如果样本吸光值大于0.7,建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 冬青加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g/min 4℃离心 10min,取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 A 测定管=0.220,A 空白管=0.114,A 标准管=0.146,按样本质量计算得:
柠檬酸含量(μmol/g 质量)=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4=33.13 μmol/g 质量。
2、 取 0.1g 大鼠肌肉组织加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g/min 4℃离心 10min,取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 A 测定管= 0.347,A 空白管=0.114,A 标准管=0.146,按样本质量计算得:
柠檬酸含量(μmol/g 质量)=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4=72.81 μmol/g 质量。
3、 取 0.1mL 小鼠血清加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g/min 4℃离心 10min,取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 A 测定管=0.201,A 空白管=0.114,A 标准管=0.146,按液体样本的体积计算:
柠檬酸含量(mmol/L)=2.5×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ×4=27.19 mmol/L。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!