产品详情
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液二:易挥发试剂,用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存;
2、 试剂一:临用前加入 5 mL 试剂三,充分溶解待用;
3、 试剂二:临用前加入 5 mL 试剂三,充分溶解待用;
4、 试剂四:临用前加入 0.375 mL 双蒸水,充分溶解待用;
5、 标准品:10 mg α-酮戊二酸。临用前加入 684 μL 蒸馏水,配成 100 μmol/mL 标准液;
6、 工作液的配制:临用前根据用量将试剂一、试剂二按 1:1 比例混合,现配现用。
产品说明:
线粒体异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,ICDHm),广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式,以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶,和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
异柠檬酸脱氢酶的主要功能,是在体内三羧酸循环中,催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,将NAD还原成NADH,通过测定α-酮戊二酸的生成量,可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 称取约 0.2 g 组织或收集 1000 万细胞,加入 1mL 提取液一和 10μL 提取液二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 4℃,1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。
3. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4. 在沉淀中加入 400μL 提取液三和 4μL 提取液二,超声波破碎(功率 40%,超声 5 秒,间隔 9 秒,4min),4℃,10000g 离心 10min,取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。
3、 操作表(在0.6 mLEP管/96孔板中进行如下操作):
三、ICDHm活性计算
注意事项:
1、 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1),可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。
2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
实验实例:
1、 取 0.2g 小鼠肾脏加入 1.5 mL 提取液一和 15 μL 提取液二,用冰浴匀浆器匀浆。4℃,1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物,在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL提取液二,超声波破碎,4℃,10000g 离心 10min,取上清液,分别按操作步骤检测,用 96 孔板测得:胞浆 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=0.25-0.25=0,线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.433-0.279=0.154,带入标准曲线 y=0.5533x+0.0319 计算 x 值,按样本质量计算酶活得:胞浆中 ICDHm 活性(U/g 质量)=16.83×x÷W=0U/g 质量,线粒体中 ICDHm 活性(U/g 质量)=6.73×x÷W=7.43 U/g 质量,样本总 ICDHm(U/g 质量)=16.83×x÷W+6.73×x÷W=7.43 U/g 质量。
2、 取 0.3g 黑麦草加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二,用冰浴匀浆器匀浆。4℃,1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物,上清液稀释 2 倍,在沉淀中加入 600μL提取液三和 6μL 提取液二,超声波破碎,4℃,10000g 离心 10min,取上清液稀释 2 倍,分别按操作步骤检测,用96孔板测得:胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0.377-0.34=0.037,线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.711-0.649=0.062,带入标准曲线 y=0.5533x+0.0319 计算 x 值,按样本质量计算酶活得:胞浆中 ICDHm 活性(U/g质量)=16.83×x÷W×2=1.55 U/g 质量,线粒体中 ICDHm 活性(U/g 质量)=6.73×x÷W×2=3.66U/g 质量,样本总 ICDHm(U/g 质量)=16.83×x÷W×2+9.16×x÷W×2=5.21 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!