产品详情
山梨醇脱氢酶(SDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:取 3.4 mL 试剂五加入 1 瓶试剂一粉剂中溶解,再加入一支试剂四,现用现配,24 h 变质;
2、 标准品:临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 10 μmol/mL NADH 标准品。-20℃保存 4 周,避免反复冻融。
产品说明:
SDH(EC 1.1.1.14)催化山梨醇脱氢生成果糖,是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。SDH 催化山梨醇脱氢生成果糖,同时还原 NAD+生成 NADH,生成的 NADH 能将电子传递给 NBT 生成紫色的甲臜,根据这一原理可以计算 SDH 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪,可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000×g 4℃离心 10 min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000 ×g 4℃离心 10 min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 570 nm,可见分光光度计蒸馏水调零。
2、标准管的测定:将 10 μmol/mL NADH 标准品用水稀释至 1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL的标准溶液
(1) 标准品稀释表
(2)标准品测定表
3、样本的测定:
三、SDH 活性计算
注意事项:
1.ΔA 大于 0.7 时,建议将样本用提取液稀释后测量,计算公式中乘以稀释倍数。
2.测定过程中样本和工作液在冰上放置,以免变性和失活。
3.比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!