产品详情
线粒体复合体Ⅱ活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:溶于 1 mL 丙酮,可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用。
2、 试剂三:临用前加入 2 mL 丙酮溶解备用。
3、 工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三按 1:1 混合,现用现配。
产品说明:
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1.0 mL提取液,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
2、 4 ℃ 600g离心10min。将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000g离心15min。
3、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4、 在沉淀中加入400μL提取液,超声波破碎(功率20%,超声5秒,间隔10秒,重复15次),用于复合体Ⅱ酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)预热15min。
3、 在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入:
三、复合体Ⅱ活力单位的计算
注意事项:
1、 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1.5),可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4,需将样本稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数);若ΔA偏小,则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
2、 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
3、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4、 本试剂盒试剂足够完成100管反应。
5、 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为100T/48S)
实验实例:
1. 取0.1g兔子肾脏样本加入1mL提取液进行匀浆研磨离心,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得ΔA1=A1-A2=0.9851-0.7974=0.1877,ΔA2=A1-A2=1.2561-0.9659=0.2902,则按样本质量计算得:
上清中复合体II活性(U/g 质量)=476.2×ΔA1÷W =476.2×0.1877÷0.1=893.8274 U/g 质量
沉淀中复合体II活性(U/g 质量)=190.5×ΔA2÷W=190.5×0.2902÷0.1=552.831 U/g 质量
复合体II(U/g 质量)=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W =1446.658 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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