产品详情
糖原磷酸化酶 a(GPa)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 0.5 mL 蒸馏水,充分混匀;
2、 试剂三:临用前加入 0.5 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前加入 1.25 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
4、 试剂五:临用前取一支加入 1 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;1 瓶粉剂即可做 100T,为延长使用时间,故多给一支。
5、 试剂六:临用前取一支加入 1 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;1 瓶粉剂即可做 100T,为延长使用时间,故多给一支。
6、 工作液的配制:临用前根据实验所需用量,按照试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:蒸馏水=148μL:4μL: 4μL: 4μL: 10μL(1T 的量)的比例,充分混匀,现用现配。
产品说明:
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 8000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
2、细菌或者细胞:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆):直接检测
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、 临用前工作液置于 37℃预热 5min。
3、 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 样本、10 μL 试剂五、10 μL 试剂六、170 μL 工作液,充分混匀 10s,记录 340nm 处 10s 时吸光值 A1,37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min(酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃),反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。
三、糖原磷酸化酶 a(GPa)活性计算
注意事项:
1、如果 ΔA>0.6,建议稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低或接近空白 OD
值,建议增加样本量后再进行测定。
实验实例:
1. 称取 0.1 g 兔子肝脏组织,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清置于冰上待测。按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测定后计算 ΔA=A2-A1=0.3472-0.2253=0.1219,按公式计算活性:
GPa(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=321.54×0.1219÷W=391.96 U/g 质量
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!